לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca^{2 +} וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Summary

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa ^{2 +,} sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

Abstract

פציעת קרום פלזמה היא אירוע תכוף, ופצעים צריכים להיות מתוקנים במהירות כדי להבטיח את הישרדות סלולרית. זרם של Ca ^{2 +} הוא אירוע איתות מרכזי שמפעיל את התיקון מפצעים מכאניים על קרום הפלזמה בתוך ~ 30 שניות. מחקרים שנעשה לאחרונה גילו כי בתאי יונקים גם לאטום קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם נקבובית ויוצר רעלים בCa ^{2 +} תלוי תהליך שכרוך exocytosis של sphingomyelinase חומצת אנזים lysosomal אחרי אנדוציטוזה הנקבובית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ששמשה כדי להדגים שהודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized ידי O streptolysin הרעל הוא גם מהירים ותלויים Ca ^{2 +} זרם. עיצוב assay מאפשר סינכרון של אירוע פציעה ומדידה קינטית מדויקת של היכולת של תאים כדי לשחזר את שלמות קרום פלזמה על ידי הדמיה וכימותים על ידי שצבע liphophilic FM1-43 מגיע קרומים תאיים המידה. als assay החי זהo מאפשרת הערכה רגישה ליכולתה של אקסוגני הוסיפה גורמים מסיסים כגון sphingomyelinase לעכב זרם FM1-43, המשקפת את היכולת של תאים לתיקון קרום הפלזמה שלהם. assay זה אפשר לנו להראות בפעם הראשונה שsphingomyelinase פועל במורד הזרם של ² exocytosis ⁺ תלוי Ca, שכן בנוסף תאי של האנזים מקדם הודבק מכתבים מחדש של תאי permeabilized בהעדר Ca ^{2 +.}

Introduction

זה כבר ידוע במשך כמה עשורים שתיקון קרום פלזמה לאחר פגיעה מכאנית הוא ^1,2 Ca ^{2 +} תלוי תהליך. מאוחר יותר מחקרים הראו כי זרם Ca ^{2 +} דרך הפצע מפעיל תהליך נמרץ של exocytosis של שלפוחית ​​תאית באתר של פציעה, אשר נדרש לresealing ^3,4. שיעור ההפסד של צבע פלואורסצנטי נטען לתוך הציטופלסמה של תאים שימש להערכה מהירה של תיקון, והגיע למסקנה כי resealing הושלם בתוך <30 שניות לאחר פציעה ^5. שני דגמים בתחילה הוצעו כדי להסביר את הדרישה לexocytosis בתיקון קרום פלזמה: 1) מודל "התיקון", שהציע כי Ca ^{2 +} זרם דרך הנגע מפעיל היתוך תחילה homotypic של שלפוחית ​​תאית, ויוצר "תיקון" גדול שהיית לאחר מכן ניתן יהיה להחיל את קרום הפלזמה ללאטום את הפצע ⁶ ו 2) מודל הפחתת מתח, אשר הציע כי adde הקרוםד על ידי ² exocytosis ⁺ תלוי Ca באזור הפצע הייתי להפחית את מתח קרום פלזמה, בהנחיית הודבקה מכתבים מחדש של bilayer ^7. התפקיד של ² exocytosis ⁺ מופעל-Ca בתיקון קרום פלזמה התחזק עוד יותר על ידי מחקרים המראים כי lysosomes מכיל מולקולת Ca ^{2 +} חיישן, synaptotagmin שביעי, המאפשרת exocytosis ותיקון קרום פלזמה בתאים נפצעו ^8,9,10,11 .

עם זאת, ראיות נוספות ציינו כי exocytosis לבד לא הייתה מספיק כדי לקדם את תיקון קרום פלזמה. בנוסף לדמעות מכאניות על קרום הפלזמה, צורה שכיחה של פגיעה בתא היא permeabilization ידי רעלים יוצרים נקבוביות המיוצרים על ידי חיידקים ^12,13 או תאים חיסוניים ^14,15. שלא כמו דמעות מכאניות, חלבוני יוצרים נקבוביות להכניס את עצמם בקרום הפלזמה יוצרים נקבובית שלא ניתן resealed פשוט על ידי יישום "תיקון" קרום או על ידי reduc יציב, מרופד בחלבוןing מתח קרום. מסקרן, מחקרים גילו כי יש לי תאי יונקים מנגנון יעיל כדי לתקן את קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, ותהליך זה דורש גם את הנוכחות של Ca ^{2 + 12} תאיים. ממצא זה העלה את השאלה האם ההסרה נקבובית הטרנסממברני מתא השטח הייתה גם תהליך מהיר, כפי שנצפה עם פצעים מכאניים ^5. באופן מפתיע, המחקרים האחרונים שלנו גילו כי הודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized עם רעלים יוצרים נקבוביות יש מאפיינים דומים מאוד לתיקון של פצעים מכאניים: התהליך דורש תאי Ca ^{2 +,} והוא יושלם תוך ~ 30 שניות. חוקר את התהליך הזה בפירוט רב יותר, נודע לנו לאחרונה כי בנוסף לCa ^{2 +} exocytosis המוסדר של lysosomes, תיקון קרום פלזמה כרוך צורה מהירה של אנדוציטוזה, אשר מופעלת על ידי שחרורו של lysosomal אנזים sphingomyelinase חומצה (ASM) והוא חיוני לא רק עבור ההסרת דואר של נקבוביות הטרנסממברני, אלא גם לתיקון של פצעים מכאניים ^16.

כדי לקבוע את קינטיקה של תא הודבק מכתבים מחדש לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, במעבדה שלנו אנו הותאמו המתודולוגיה הדמיה חיה שהיה בשימוש בעבר כדי להעריך הודבק מכתבים מחדש של סיבי שריר מבודדים-נפצע לייזר ^17. assay זה מסתמך על מאפיינים של הצבע lipophilic FM1-43, שintercalates יציבות לעלון החיצוני של bilayers שומנים וגוברים בעוצמת הקרינה. כאשר bilayer קרום הפלזמה מופר מקבלת גישה לצבוע תאית לקרומים תאיים, מתן assay רגיש כדי לזהות פציעת קרום פלזמה ולתקן ^18,16,19,20. להסתגל assay זה להערכת הודבק מכתבים מחדש תא לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, אנו מראש מודגרות-תאים ב 4 ° C עם O חיידקי streptolysin רעלן (SLO), אשר נקשר לכולסטרול קרום ^21. תא סינכרוניpermeabilization אז יכול להיות מושגת בקלות על ידי הזזת התאים מקרח להתחמם בינוני בבמת מיקרוסקופ מחוממת, אשר מפעילה את oligomerization ושינוי בקונפורמציה שמוביל לtransmembrane היווצרות נקבובית. יתרון של גישה זו, על מבחני שפורסמו בעבר באמצעות פציעת לייזר, הוא שמספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח בו זמנית בשדה מיקרוסקופי, מתן דגימה טובה יותר של אוכלוסיית התאים. בהתחשב בדמיון מכניסטית בין התהליך הודבק מכתבים מחדש תא ראה לאחר פציעה מכאנית וpermeabilization עם רעלים יוצרים נקבוביות, assay אנו מתארים כאן מספק שיטה מאוד תכליתית ורבה עוצמה עבור לנתח גורמים מעורבים בתהליך היסודי של תיקון קרום פלזמה. כדוגמא, אנו מראים כי ניתן להשתמש assay זה לזהות צעדי Ca ^{2 +} תלויים ובלתי תלויים בתהליך התיקון.

Protocol

1. תעתיק השתקה של ASM זרעים 1.5 x 10 5 תאי הלה ב2 מיליליטר של תקשורת צמיחת DMEM (גלוקוז גבוהה DMEM עם 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פן סטרפטוקוקוס) על מנות תחתית כוס 35 מ"מ (MatTek) ו דגירה לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס חממ…

Representative Results

ריכוזים נמוך של תיקון קרום פלזמה הצלת sphingomyelinase (SM) חיידקים בתאים מדולדלים בsphingomyelinase חומצת lysosomal. באמצעות assay ההדמיה FM1-43, הראינו בעבר כי תאים לקויים לASM אנזים lysosomal ונחשפו לSLO פצע בנוכחות של Ca 2 + להיות בעל מום קרום פלזמה הוא חולץ ?…

Discussion

מחקרים קודמים על תיקון פגיעה וקרום פלזמה מכאני הסתמכו על מנגנונים שונים של תאים ופצעו, החל מהטלת חרוזי זכוכית, micropipetting, גז, שריטות או גירוד. את ההודעה של כל מבחני האלה היה איכותיים ולא כמוני, ולא לתת מידע מדויק על קינטיקה של מנגנון התיקון. היכולת של תאי reseal קרום הפלזמה ?…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber