Sanntids avbildning av celler eksponert for den lipofile fargestoff FM1-43 tillater nøyaktig bestemmelse av kinetikken ved hvilken poredannende toksiner blir fjernet fra plasmamembranen. Dette er en følsom analyse som kan brukes til å vurdere krav Ca 2 +, sphingomyelinase og andre faktorer på plasmamembranen reparasjon.
Plasma membranskade er en hyppig hendelse, og sårene har til å bli hurtig utbedres for å sikre celle overlevelse. Tilstrømningen av Ca 2 + er en viktig signal hendelse som utløser reparasjon av mekaniske skader på plasma membranen innenfor ~ 30 sek. Nyere studier viser at pattedyrceller også forsegle sine plasmamembran etter permeabilization med pore danner giftstoffer i en Ca 2 +-avhengig prosess som involverer eksocytose av lysosomalenzymet syre sphingomyelinase fulgt av pore endocytose. Her beskriver vi metodene som er brukt for å vise at den forsegles av celler permeabilized av toksinet streptolysin O er også rask og avhengig av Ca 2 + tilstrømningen. Analysen utforming tillater synkronisering av skaden arrangement og en presis måling av kinetiske evne til å gjenopprette celler plasmamembranintegritet etter avbildning og kvantifisere omfanget hvorved liphophilic fargestoff FM1-43 nådd intracellulære membraner. Denne live analyse also tillater en følsom vurdering av evnen til eksogent tilsatt løselige faktorer som sphingomyelinase å inhibere FM1-43 strøm, som gjenspeiler evnen til cellene å reparere deres plasma membran. Denne analysen tillater oss å vise for første gang at sphingomyelinase opptrer nedstrøms av Ca 2 +-avhengige exocytose, siden ekstracellulære tilsetning av enzymet fremmer forsegles av celler permeabilized i fravær av Ca 2 +.
Det har vært kjent i flere tiår at plasma membran reparasjon etter mekanisk skade er en Ca 2 +-avhengig prosess 1,2. Senere studier viste at Ca 2 + tilstrømningen gjennom såret utløser en kraftig prosess med eksocytose av intracellulære vesikler på stedet av skader, noe som er nødvendig for forsegles 3,4. Satsen for tap av et fluorescerende fargestoff lastet inn i cytoplasma av celler ble brukt til å vurdere hastigheten på reparasjon, og konkluderte med at forsegles ble fullført innen <30 sek etter skade fem. To modeller ble opprinnelig foreslått å forklare behovet for eksocytose i plasma membran reparasjon: 1) "patch"-modellen, som antydet at Ca 2 + tilstrømningen gjennom lesjonen utløser i utgangspunktet homotypic fusjon av intracellulære vesikler, danner en stor "patch" som ville deretter brukes på plasmamembranen til å forsegle såret 6 og 2) å redusere spenningen modellen, som foreslått at membranen added av Ca 2 +-avhengige exocytose i nærheten av såret ville redusere plasma membran spenning, tilrettelegging forsegles av bilayer 7.. Rollen av Ca 2 +-utløst eksocytose i plasma membran reparasjon ble ytterligere forsterket av studier som viser at lysosomes inneholde en Ca 2 + sensor molekyl, synaptotagmin VII, som forenkler deres eksocytose og plasma membran reparasjon i skadde celler 8,9,10,11 .
Imidlertid har ytterligere bevis indikerte at exocytose alene ikke var tilstrekkelig for å fremme plasma membran reparasjon. I tillegg til mekaniske tårer på plasmamembranen, er en vanlig form for celleskade permeabilization av poredannende toksiner produsert av bakterier 12,13 eller immunceller 14,15. I motsetning til mekaniske tårer, pore-dannende proteiner som setter seg på plasmamembranen danner en stabil, protein-foret porer som ikke kan lukkes igjen ved å anvende en membran "patch" eller ved reduksjoning membran spenning. Intriguingly studier vist at pattedyrcellene har en effektiv mekanisme for å reparere deres plasma membran etter permeabilization med pore-dannende proteiner, og denne prosessen krever også tilstedeværelse av ekstracellulær Ca 2 + 12. Dette funnet reist spørsmålet om hvorvidt transmembrane pore fjerning fra celleoverflaten var også en rask prosess, som observert med mekaniske sår 5. Overraskende, våre nyere studier viste at resealing av celler permeabilized med poredannende giftstoffer har svært like egenskaper som reparasjon av mekaniske sår: prosessen krever ekstracellulære Ca 2 +, og er fullført innen ~ 30 sek. Gransker denne prosessen i mer detalj, vi har nylig lært at i tillegg til Ca 2 +-regulert eksocytose av lysosomer, innebærer plasma membran reparere en rask form for endocytose, som er utløst av utgivelsen av lysosomalenzymet syre sphingomyelinase (ASM) og er avgjørende ikke bare for the fjerning av transmembrane porene, men også for reparasjon av mekaniske sår 16.
For å bestemme kinetikken av celle resealing etter permeabilization med poredannende proteiner, i vårt laboratorium vi tilpasset en direkte avbildning metodikk som hadde blitt brukt tidligere for å vurdere resealing av laser-skadet isolerte muskelfibre 17. Denne analysen er avhengig av egenskapene til den lipofile fargestoff FM1-43, som stabilt intercalates inn i den ytre paknings av lipid dobbeltlag øker i fluorescensintensiteten. Når plasma membranen bilayer blir forstyrret ekstracellulære fargestoff får tilgang til intracellulære membraner, som gir en følsom analyse for å påvise plasma membran skader og reparere 18,16,19,20. For å tilpasse denne assay for vurdering av cellen forsegles etter permeabilization med pore-dannende proteiner, vi pre-inkuberes cellene ved 4 ° C med den bakterielle toksin streptolysin O (SLO), som binder seg til membrankolesterol 21.. Synkron cellepermeabilization kan da lett oppnås ved å føre cellene fra isen for å varme medium i en oppvarmet objektbord, som aktiverer oligomerisering og forandring i konformasjon som fører til transmembrane poredannelse. En fordel med denne tilnærming, i de tidligere publiserte analyser ved hjelp av laser såret, er at et større antall celler kan bli analysert samtidig i en mikroskopisk felt, noe som gir bedre utvalg av cellepopulasjonen. Analysen vi beskriver her gitt mekanistiske likheter mellom cellen resealing prosessen sett etter mekanisk skade og permeabilization med poredannende giftstoffer, gir en meget allsidig og kraftig metode for å dissekere faktorer involvert i den grunnleggende prosessen med plasma membran reparasjon. Som et eksempel viser vi at det er mulig å bruke denne analysen å identifisere Ca 2 +-avhengige og uavhengige trinn av reparasjonsprosessen.
Tidligere studier på mekanisk skade og plasma membran reparasjon stolt på ulike mekanismer for å skade celler, alt fra slippe glassperler, micropipetting, klipping, riper eller skraper. Avlesning av alle disse analysene var kvalitativ snarere enn kvantitativ, og ikke gi presis informasjon om kinetikken av reparasjonsmekanismen. Muligheten av celler for å forsegle deres plasma membran etter at disse former for skade ble målt i nærvær eller fravær av sporstoff tilsatt i ekstracellulær væske i cytoplasma, gjennom…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R37 AI34867 og R01 GM064625 til NWA Vi takker Dr. R. Tweten fra University of Oklahoma for SLO ekspresjonsplasmid.
Reagent | |||
HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
Material | |||
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber |