Живая съемка Пробирной для оценки роли Са^{2 +} И сфингомиелиназы в Ремонт порообразующих токсинного ран

Summary

Живая съемка клеток, подвергнутых воздействию липофильном красителя FM1-43 позволяет точно определить кинетики с помощью которого порообразующие токсины удаляются из плазматической мембраны. Это чувствительным анализом, который может быть использован для оценки требований к Ca ^{2 +,} сфингомиелиназы и других факторов на плазменной ремонта мембраны.

Abstract

Мембрана травмы плазменным является частым событием, и раны должны быть быстро восстановлены для обеспечения выживания клеток. Приток Ca ^{2 +} является ключевым событием сигнализации, который вызывает ремонт механических ран на плазматической мембране в пределах ~ 30 сек. Недавние исследования показали, что клетки млекопитающих также запечатать их плазматическую мембрану после пермеабилизации с пор формирования токсины в Ca ^{2 +-зависимой} процесс, который включает экзоцитоз в сфингомиелиназы лизосомальный фермент кислоты с последующим пор эндоцитоза. Здесь мы описываем методологию, используемую для демонстрации того, что Пересчет ячеек пермеабилизированных по токсин стрептолизином O также быстрое и зависит от Ca ^{2 +} притока. Конструкция анализ позволяет синхронизировать случае травмы и точное кинетическое измерение способности клеток для восстановления целостности мембраны плазмы путем визуализации и количественного определения степени, в какой liphophilic краситель FM1-43 достигает внутриклеточных мембран. Этот живой лов анализовO позволяет чувствительным оценка способности экзогенно добавленные растворимых факторов, таких как сфингомиелиназы ингибировать FM1-43 притока, отражающий способность клеток восстанавливать их плазматической мембране. Этот анализ позволил нам показывают впервые, что сфингомиелиназы действует ниже Ca ^{2 +-зависимого} экзоцитоза, поскольку внеклеточный добавление фермента способствует восковые колпачки с точными клеток проницаемыми в отсутствие Ca ^{2 +.}

Introduction

Она была известна в течение нескольких десятилетий, что плазматическая мембрана ремонт после механических повреждений является Са ^{2 +-зависимый} процесс ^1,2. Более поздние исследования показали, что Са ^{2 +} приток через рану вызывает энергичную процесс экзоцитоза внутриклеточных везикул на месте травмы, которая необходима для опечатывания ^3,4. Скорость потери флуоресцентным красителем, загруженного в цитоплазме клеток использовали для оценки скорости ремонта, и пришли к выводу, что опечатывания был завершен в течение <30 сек после травмы ^5. Две модели были изначально предложены для объяснения требование экзоцитоза в плазмалеммы ремонта: 1) модель "патч", который предположил, что Са ^{2 +} приток через поражения вызывает первоначально гомотипическую слияние внутриклеточных везикул, образуя большой "патч", что бы затем применяться к плазменной мембране, чтобы запечатать рану ⁶ и 2) модель уменьшения напряженности, в котором предлагается, что мембраны Addeд по Ca ^{2 +-зависимой} экзоцитоза в непосредственной близости от раны приведет к сокращению ПЛАЗМАЛЕММЫ напряжение, облегчая восковые колпачки с точными бислоя ^7. Роль Ca ^{2 +} вызвало экзоцитоза в плазме ремонта мембраны получила дальнейшее развитие в исследованиях, показывающих, что лизосомы содержат молекулу Са ^{2 +} датчик, Synaptotagmin VII, что облегчает их экзоцитоза и плазменный ремонт мембранной в поврежденных клетках ^8,9,10,11 .

Тем не менее, дополнительные доказательства показали, что в одиночку экзоцитоза не было достаточно, чтобы способствовать плазменный ремонт мембраны. В дополнение к механическим слезы на плазматической мембране, частая форма повреждения клеток является пермеабилизации по порообразующих токсинов, продуцируемых бактериями ^12,13 или ^14,15 иммунных клеток. В отличие от механических слез, порообразующие белки включить себя на плазматической мембране формирования стабильного белка, вдоль поры, которые не могут быть опечатана просто путем применения мембраны "заплату" или сокращеING мембраны напряжение. Интересно, что исследования показали, что клетки млекопитающих имеют эффективный механизм для восстановления их плазматическую мембрану после пермеабилизации с порообразующих белков, и этот процесс также требует присутствия внеклеточного Ca ^{2 + 12.} Это открытие поднял вопрос о том, был также удаление трансмембранного пор от поверхности клетки быстрый процесс, как это наблюдается с механическими ран ^5. Удивительно, но наши последние исследования показали, что Пересчет ячеек пермеабилизированных с порообразующих токсинов имеет очень похожие свойства ремонта механических ран: процесс требует внеклеточного Са ^{2 +,} и завершается в течение ~ 30 сек. Исследуя этот процесс более подробно, мы недавно узнали, что в дополнение к Ca ^{2 +-регулируемого} экзоцитоза лизосом, плазматическая мембрана ремонт включает в себя быстрое форму эндоцитоза, который срабатывает при выпуске лизосомальных ферментов кислоты сфингомиелиназу (ASM) и имеет важное значение не только для гое удаление трансмембранных пор, но и для ремонта механических ран ^16.

Для определения кинетики клеток опечатывания после пермеабилизации с порообразующих белков, в нашей лаборатории мы адаптировали живой методологию формирования изображения, которая использовалась ранее для оценки восковые колпачки с точными лазерных повредил изолированных мышечных волокон ^17. Этот анализ основан на использовании свойств липофильного красителя FM1-43, который стабильно встраивается в наружном листке липидных бислоев увеличением интенсивности флуоресценции. Когда плазма мембраны двухслойная нарушается прибыль внеклеточных краситель доступ к внутриклеточным мембран, обеспечивая чувствительного анализа для обнаружения плазменный травмы мембраны и ремонт ^18,16,19,20. Чтобы адаптировать этот анализ для оценки клеточной проницаемости после повторной герметизации с порообразующих протеинов, мы предварительно инкубировали клетки при 4 ° С с бактериальным токсином стрептолизином O (SLO), который связывается с мембраной холестерина ^21. Синхронный клетокпермеабилизации затем может быть легко достигнуто путем перемещения клетки от льда, чтобы нагреть среду в отапливаемом столике микроскопа, который активизирует олигомеризации и изменение конформации, что приводит к образованию трансмембранные пор. Преимущество этого подхода, более ранее опубликованных анализов с помощью лазерного ранения, в том, что большее число клеток могут анализироваться одновременно в микроскопической области, обеспечивая лучшую выборки клеточной популяции. Учитывая механистические сходство между процессом клеток опечатывания видел после механической травмы и проницаемости с порообразующих токсинов, анализ мы описываем здесь обеспечивает очень универсальный и мощный метод для рассечения факторы, влияющие на фундаментального процесса плазменной ремонта мембраны. В качестве примера, мы показываем, что можно использовать этот анализ для выявления Са ^{2 +} зависимые и независимые этапы процесса ремонта.

Protocol

1. Транскрипции Подавление АНМ Семя 1,5 х 10 5 клеток HeLa в 2 мл питательной среды DMEM (DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1% Penn-Strep) на 35 мм со стеклянным дном посуды (Маттек) и Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2 …

Representative Results

Низкие концентрации бактериальной сфингомиелиназы (SM) спасательные плазмы мембраны ремонта в клетках обедненных сфингомиелиназы лизосомальных кислоты. Использование FM1-43 формирования изображения анализа, ранее мы показали, что клетки с дефицитом для лизосомальных фер?…

Discussion

Более ранние исследования на механической травмы и плазмалеммы ремонта полагались на различных механизмов, вредящих клеток, начиная от падения стеклянные бусы, micropipetting, отрезные, царапин или выскабливание. Показания всех этих анализов была качественной, а не количественной, а не дать …

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber