Live Imaging analys för bedömning av roller Ca^{2 +} Och sfingomyelinas i Reparation av por-bildande Toxin Wounds

Summary

Live avbildning av celler som utsätts för den lipofila färgämnet FM1-43 möjliggör exakt bestämning av kinetiken genom vilken por-bildande toxiner avlägsnas från plasmamembranet. Detta är en känslig analys som kan användas för att bedöma kraven för ^{Ca2 +,} sfingomyelinas och andra faktorer på plasmamembran reparation.

Abstract

Plasma membranskada är en vanlig händelse, och sår måste snabbt repareras för att säkerställa cellöverlevnad. Flödet av Ca ^{2 +} är en viktig signalerande händelse som utlöser reparation av mekaniska skador på plasmamembranet inom ~ 30 sek. Nyligen genomförda studier visar att däggdjursceller återför även deras plasmamembran efter permeabilisering med por bildar toxiner i en ^{2 +-beroende} process Ca som involverar exocytos av det lysosomala enzymet surt sfingomyelinas följt av por endocytos. Här beskriver vi den metod som används för att visa att den återförslutning av celler permeabilized av toxinet streptolysin O är också snabb och beroende av ^{Ca2 +} inflöde. Analysen design tillåter synkronisering av händelsen skada och en noggrann kinetisk mätning av förmågan hos celler att återställa plasmamembranintegritet, genom att avbilda och kvantifiera den utsträckning varmed lipofil färgämnet FM1-43 når intracellulära membran. Denna levande analys also medger en känslig bedömning av förmågan hos exogent tillsatt lösliga faktorer såsom sfingomyelinas att inhibera FM1-43 tillströmning, vilket återspeglar förmågan hos celler att reparera sitt plasmamembran. Denna analys tillät oss att visa för första gången att sfingomyelinas verkar nedströms av Ca ^{2 +-beroende} exocytos, eftersom extracellulärt tillsats av enzymet främjar återförslutning av celler permeabiliserade i frånvaro av ^{Ca2 +.}

Introduction

Det har varit känt under flera årtionden att plasmamembranet reparation efter mekanisk skada är en Ca ^{2 +-beroende} process ^1,2. Senare studier visade att ^{Ca2 +} inflöde genom såret utlöser en kraftfull process för exocytos av intracellulära vesiklar vid platsen för skadan, vilket krävs för återförslutning ^3,4. Graden av förlust av ett fluorescerande färgämne laddas in i cytoplasman av celler användes för att bedöma hastigheten på reparation, och drog slutsatsen att återförslutning fördes inom <30 sek efter skada ^5. Två modeller ursprungligen föreslagits för att förklara kravet på exocytos i plasmamembranet reparation: 1) den "patch"-modellen, som föreslog att ^{Ca2 +} inflöde genom lesionen utlöser en början homotypisk fusion av intracellulära vesiklar, som utgör en stor "patch" som skulle sedan appliceras till plasmamembranet för att återförsluta såret ⁶ och 2) modell spänningen reduktion, där det föreslås att membranet added med ^{Ca2 +-beroende} exocytos i närheten av såret skulle reducera plasmamembranspänning, underlätta återförslutning av dubbelskiktet ^7. Rollen av ^{Ca2 +-utlöst} exocytos i plasmamembranet reparation förstärktes ytterligare av studier som visar att lysosomer innehåller en ^{Ca2 +-sensor} molekyl, synaptotagmin VII, vilket underlättar exocytos och plasmamembran reparation i skadade celler ^8,9,10,11 .

Dock har ytterligare bevisning visade att enbart exocytos inte var tillräckliga för att främja plasmamembran reparation. Förutom mekaniska tårar på plasmamembranet, är permeabilisering av porbildande toxiner producerade av bakterier ^12,13 eller immunceller ^14,15 en frekvent form av cellskada. Till skillnad från mekaniska tårar, porbildande proteiner infoga sig på plasmamembranet som bildar en stabil, protein-fodrade por som inte kan återförslutas genom att helt enkelt applicera en membran "patch", eller genom att minskaningsmembranspänning. Intriguingly studier visade att däggdjursceller har en effektiv mekanism för att reparera deras plasmamembran efter permeabilisering med por bildande proteiner, och denna process kräver också närvaron av extracellulärt ^{Ca2 + 12.} Detta fynd tog upp frågan om huruvida trans por bort från cellytan var också en snabb process, som observerats med mekaniska sår ^5. Överraskande nog visade vår nya studier att återförslutning av celler permeabiliserade med por-bildande toxiner har mycket liknande egenskaper som reparation av mekaniska sår: processen kräver extracellulära ^{Ca2 +,} och slutförs inom ~ 30 sek. Undersökning av denna process i större detalj, som nyligen har vi lärt oss att förutom Ca ^{2 +-reglerad} exocytos av lysosomer involverar plasmamembranet reparera en snabb form av endocytos, som triggas av frisättningen av det lysosomala enzymet surt sfingomyelinas (ASM) och är nödvändig inte bara för the avlägsnande av trans porer, men även för reparation av mekaniska sår ^16.

För att bestämma kinetiken hos cellåterförslutning efter permeabilisering med porbildande proteiner, i vårt laboratorium har vi anpassat en levande avbildning metod som hade använts tidigare för att bedöma återförslutning av laser skadade isolerade muskelfibrer ^17. Denna analys bygger på egenskaper hos den lipofila färgämnet FM1-43, som stabilt interkalerar i den yttre broschyren av lipidbiskikt ökar i fluorescensintensiteten. När plasma membranbiskiktet störs cellulära färgämnes får tillgång till intracellulära membran, som ger en känslig analys för att detektera plasmamembranet skada och reparera ^18,16,19,20. För att anpassa denna analys för bedömning av cell återförslutning efter permeabilisering med porbildande proteiner, vi förinkuberas cellerna vid 4 ° C med bakteriellt toxin streptolysin O (SLO), som binder till membran kolesterol ^21. Synkron cellpermeabilisering kan sedan lätt uppnås genom att förflytta cellerna från isen att värma mediet i ett uppvärmt mikroskop skede, som aktiverar oligomerisering och förändring i konformationen som leder till transmembran porbildning. En fördel med denna metod, under de tidigare publicerade analyser med hjälp av laser såra, är att ett större antal celler kan analyseras samtidigt i ett mikroskopiskt område, vilket ger bättre provtagning av cellpopulationen. Med tanke på de mekanistiska likheterna mellan cellåterförslutningsprocessen ses efter mekanisk skada och permeabilisering med por-bildande toxiner, analysen beskriver vi här ger en mycket mångsidig och kraftfull metod för att dissekera faktorer som den grundläggande processen för plasmamembran reparation. Som ett exempel, visar vi att det är möjligt att använda denna analys för att identifiera ^{Ca2 +-beroende} och oberoende steg i reparationsprocessen.

Protocol

1. Transcriptional tysta av ASM Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM-odlingsmedium (DMEM hög glukoshalt med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glas botten rätter (MatTek) och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Följande dag, aspirera utanför tillväxtmedier och ersätta den med 2 ml DMEM minskat serum-medium (DMEM med 4% FBS), minst 1 timme före tillsats av siRNA transfektion blandningen. Förbered 4 r…

Representative Results

Låga halter av bakterie sfingomyelinas (SM) räddningsplasmamembran reparation i celler utarmat på lysosomala syra sfingomyelinas. Använda FM1-43 avbildningsanalys, tidigare har vi visat att celler med brist på det lysosomala enzymet ASM och utsatta för SLO sårskada, i närvaro av Ca 2 + har en plasmamembrandefekt räddas av extracellulära tillsatsen av det rekombinanta humana enzymet 19. Eftersom humant lysosomalt ASM har ett lågt pH-optimum, undersökte vi om åt…

Discussion

Tidigare studier på mekanisk skada och plasmamembran reparation förlitat sig på olika mekanismer för skadar celler, allt från att tappa glaspärlor, mikropipettering, klippning, repor eller skrapning. Avläsningen av alla dessa analyser var kvalitativ snarare än kvantitativ, och inte ge exakta uppgifter på kinetiken för mekanismen reparation. Förmågan hos celler att återförsluta deras plasmamembranet efter det att dessa former av skador mättes genom närvaro eller frånvaro av spårämnen tillsättas till d…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber