Een Menselijke<em> Ex Vivo</em> Atherosclerotische plaque Model naar Letsel Biologie studeren
Summary
Atherosclerose is een chronisch ontstekingsproces. Dit manuscript illustreert een eenvoudig te ex vivo model te gebruiken om verse arteria carotis of coronaire plaques onderzoeken. De ex vivo model maakt het onderzoeken van potentiële stoffen op de inflammatoire milieu in humane atherosclerotische laesies en de resultaten worden geanalyseerd op verschillende manieren.
Abstract
Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte van het vaatstelsel. Er zijn verschillende methoden om de inflammatoire verbinding in atherosclerotische laesies bestuderen. Muismodellen zijn een belangrijk instrument om ontstekingsprocessen in atherosclerose te onderzoeken, maar deze modellen last van de fenotypische en functionele verschillen tussen de muizen en menselijke immuunsysteem. In vitro cel experimenten worden gebruikt om specifiek te evalueren celtype-afhankelijke veranderingen veroorzaakt door een stof van belang, maar kweekafhankelijke variaties en het onvermogen om de invloed van specifieke moleculen komen in de context van de inflammatoire verbinding in atherosclerotische laesies tegen de gevolgen van de resultaten. Bovendien meten niveaus van een molecuul van belang in menselijk bloed helpt om de klinische relevantie te onderzoeken, maar dit betekent geen systemische en lokale ontsteking. Daarom hebben we hier beschrijven een plaquette cultuur model voor de menselijke atherosclerose biologie studerenex vivo. Kortom, vers plaques verkregen van patiënten die endarteriëctomie of CABG en opgeslagen in RPMI medium op ijs tot gebruik. De monsters worden in kleine stukjes gesneden, gevolgd door willekeurige verdeling in een 48-well plaat, dat RPMI medium naast een stof van belang, zoals cytokines en chemokines, alleen of in combinatie voor bepaalde perioden. Na incubatie kan de plaque stukken schok worden ingevroren voor mRNA isolatie, ingebed in paraffine of oktober voor immunohistochemie vlekken of vernield en gelyseerd voor western blotting. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd uit de plaque voor flowcytometrie analyse. Bovendien kunnen supernatanten worden verzameld eiwit meting door ELISA. Concluderend, de gepresenteerde ex vivo model opent de mogelijkheid om verdere studie inflammatoire letsels biologie, wat kan leiden tot identificatie van mechanismen nieuwe ziekte en therapeutische doelwitten.
Introduction
Atherosclerose als een chronische ontstekingsziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken in de geïndustrialiseerde landen 1-2. Complicaties van atherosclerose, in het bijzonder acute coronaire syndromen, zijn gekoppeld aan scheuren van kwetsbare laesies, waardoor atherotrombose en vatafsluiting 3. Aangeboren en adaptieve immuniteit lijken in alle fasen van atherosclerose 2,4-5 te worden betrokken. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de behandeling van myocardinfarct, effectieve preventie van atherosclerose en cardiovasculaire gebeurtenissen zijn nog steeds niet opgelost. Aldus bestuderen letsels biologie is essentieel voor het verhogen van onze kennis over de pathofysiologie van atherosclerose en identificatie van nieuwe therapeutische doelwitten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk.
In veel gevallen worden muismodellen gebruikt om de pathofysiologie van specifieke ziekten onderzoeken. Echter, het bestuderen van atherosclerose met behulp van muismodellen is Accompanied door verscheidene beperkingen: (1) Meestal atherosclerotische muizen krijgen een hoog cholesterol dieet. Het cholesterolgehalte in deze modellen niet vergelijkbaar met die bij patiënten met verhoogde cholesterol serumspiegels 6. (2) Er bestaan aanzienlijke verschillen tussen de muizen en menselijke immuunsysteem; dus Foxp3 is een specifieke marker van muizen regulatoire T-cellen, terwijl de menselijke Foxp3 expressie in menselijke T-cellen niet noodzakelijkerwijs verleent een regelgevend fenotype 7. Ook de Th1/Th2 paradigma zoals gedefinieerd in mensen niet volledig overdraagbaar op muizen T-cellen. (3) Een aantal merkers die worden gebruikt om muizen monocyten en macrofagen als F4/80 en markers van klassieke (M1) identificeren tegen alternatieve (M2) activeringspatronen niet bestaat in humane myeloïde cellen 8. (4) Genexpressie van muizen en menselijke perifere bloedmonocyten gevonden aanzienlijk verschillend 9 te zijn.
Dus, om ons inzicht in vergrotenchronische ontstekingsprocessen in menselijke atherosclerose, moeten we gebruik van modellen die met menselijk weefsel, bloed of cellen te maken. Hier beschrijven we een model van menselijke plaque weefselkweek, die onderzoek naar mogelijke nieuwe stoffen in het concept van menselijke inflammatoire letsels biologie maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een ex vivo plaque cultuurmodel de invloed van potentieel relevante stoffen atherosclerose biologie onderzoeken. Het grote voordeel van deze ex vivo werkwijze is de mogelijkheid om de invloed van genoemde verbindingen op de inflammatoire cellen en hun cellulaire interactie en ontstekingsreacties en stromen in humane atherosclerotische lesies geëvalueerd. Verschillende bruikbare methoden (bijv. RT-PCR, western blot, immunohistochemie, flowcytometrie, ELISA) helpen om een ui…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Nadine Wambsganss voor een uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation (DFG) ER 682/2-1 en een onderzoeks-stipendium van de Duitse Vereniging voor Cardiologie aan C. Erbel evenals een onderzoek stipendium van de Duitse Academic Service Heidelberg naar L. Zhao.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | n/a |
| FCS | Gibco | 10270-106 | n/a |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | n/a |
| 15 ml tube | Sarstedt | 62,554,502 | n/a |
| culture dish (60mm) | Orange Scientific | 5550200 | n/a |
| LPS | Sigma | L4516 | n/a |
| Cell Culture Plates 48-well | Greiner | 677102 | n/a |
| Scalpel – single use | Feather | FEA200130011 | n/a |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | n/a |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | n/a |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | n/a |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | n/a | |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
