Un umano<em> Ex Vivo</em> Placca aterosclerotica modello per studiare Lesione Biologia

Summary

L'aterosclerosi è un processo infiammatorio cronico. Questo manoscritto illustra un facile da usare ex vivo modello per studiare carotidea fresco o placche coronariche. Il modello ex vivo permette la ricerca di sostanze potenziali sul milieu infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche umane ed i risultati possono essere analizzati con vari metodi.

Abstract

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica del sistema vascolare. Ci sono vari metodi per studiare il composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche. Modelli murini sono uno strumento importante per studiare i processi infiammatori in atherogenesis, ma questi modelli soffrono di differenze fenotipiche e funzionali tra il topo e il sistema immunitario umano. Gli esperimenti in vitro di cellule sono utilizzate per valutare specificamente cellulari variazioni a seconda del tipo causati da una sostanza di interesse, ma le variazioni coltura-dipendenti e l'incapacità di analizzare l'influenza delle molecole specifiche nel contesto del composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche limitano l'impatto dei risultati. Inoltre, i livelli di una molecola di interesse nel sangue umano misurazione aiuta a indagare ulteriormente la sua rilevanza clinica, ma questo rappresenta infiammazione sistemica e non locale. Pertanto, qui descriviamo un modello di coltura placca studiare lesione aterosclerotica biologia umanaex vivo. In breve, le placche freschi sono ottenuti da pazienti sottoposti ad endoarterectomia o bypass aorto-coronarico e conservati in mezzo RPMI sul ghiaccio fino al loro utilizzo. I campioni vengono tagliati in piccoli pezzi seguite da distribuzione casuale in una piastra a 48 pozzetti, contenente RPMI oltre ad una sostanza di interesse quali citochine o chemochine soli o in combinazione, per periodi di tempo definiti. Dopo l'incubazione, i pezzi di placca possono essere scossa congelati per l'isolamento di mRNA, inclusi in paraffina o ottobre per la colorazione immunoistochimica o distrutte e lisate per western blotting. Inoltre, le cellule possono essere isolate dalla placca per l'analisi di citometria a flusso. Inoltre, surnatanti possono essere raccolti per la misurazione delle proteine ​​mediante ELISA. In conclusione, la ex vivo modello presentato apre la possibilità di studiare ulteriormente infiammatoria biologia lesionale, che può provocare l'identificazione di meccanismi di malattia romanzo e bersagli terapeutici.

Introduction

Aterosclerosi come una malattia infiammatoria cronica è una delle principali cause di morte nei paesi industrializzati ^1-2. Complicazioni di aterosclerosi, sindromi coronariche acute in particolare, sono stati collegati alla rottura delle lesioni vulnerabili, causando aterotrombosi e all'occlusione del vaso ^3. L'immunità innata e adattativa sembra essere coinvolto in tutte le fasi atherogenesis ^2,4-5. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel trattamento dell'infarto miocardico, un'efficace prevenzione di aterosclerosi e di eventi cardiovascolari avversi sono ancora irrisolti. Così, lo studio della biologia lesionale è essenziale per aumentare le nostre conoscenze sulla fisiopatologia di aterosclerosi e per consentire l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie.

In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio atherogenesis utilizzando modelli murini è accompanied da diverse limitazioni: (1) Di solito, i topi aterosclerotiche ricevono una dieta ricca di colesterolo. I livelli di colesterolo in questi modelli non possono essere confrontati con quelli in pazienti con elevati livelli sierici di colesterolo ^6. (2) Ci sono differenze sostanziali tra il topo e il sistema immunitario umano; così FOXP3 è un marcatore specifico delle cellule T regolatorie murine, mentre l'espressione umana FOXP3 nelle cellule T umane non necessariamente conferisce un fenotipo regolamentazione ^7. Inoltre, il paradigma Th1/Th2 come definito negli esseri umani non è completamente trasferibile a cellule T murine. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare monociti e macrofagi murini come F4/80 e marcatori di classica (M1) vs alternativa (M2) pattern di attivazione non esiste in cellule mieloidi umane ^8. (4) L'espressione genica di monociti del sangue periferico murini e umani è stato trovato per essere sostanzialmente differente ^9.

Pertanto, al fine di aumentare la comprensione delleprocessi infiammatori cronici in aterosclerosi umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i tessuti umani, sangue o cellule. Qui, descriviamo un modello di coltura tissutale placca umana, che permette il rilevamento di eventuali sostanze romanzo nel concetto di biologia lesionale infiammatoria umana.

Protocol

1. Preparare medio come segue Cultura Media: RPMI. Aggiungere siero di vitello fetale al 10% (FCS). Aggiungere 100 U / ml di penicillina G, e 100 g / ml streptomicina. 2. Conservazione del cilindro placca fresco fino al momento dell'uso L'operazione di endoarteriectomia carotidea dei pazienti con o senza sintomi ischemici (ictus, attacco ischemico transitorio) con una significativa stenosi carotidea sarà fatto da chirurghi vascolari e …

Representative Results

Qui vi presentiamo una serie di figure che dimostrano risultati della ex vivo placca coltura. Per valutare i cambiamenti nel milieu infiammatorio in risposta all'agente di interesse nel vivo esperimento modello ex, misuriamo diverse molecole che sono noti per essere principalmente coinvolto nell'aterogenesi. Come rappresentante citochine pro-aterogeni scegliamo TNFa, IL6 e IFNg 2,11. Inoltre, utilizziamo fattore di von Willebrand e del fattore tissutale per valutare le varia…

Discussion

Qui vi presentiamo un ex vivo placca modello di coltura per studiare l'influenza di sostanze potenzialmente rilevanti sul aterosclerotica lesione biologia. Il principale vantaggio di questo metodo ex vivo è la capacità di valutare l'influenza delle sostanze indicate sulle cellule infiammatorie e la loro interazione cellulare nonché vie infiammatorie e cascate all'interno lesioni aterosclerotiche umane. Diversi metodi utilizzabili (es. RT-PCR, western blot, immunoistochimica, cit…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Gibco	21875-091	n/a
FCS	Gibco	10270-106	n/a
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458	n/a
15 ml tube	Sarstedt	62,554,502	n/a
culture dish (60mm)	Orange Scientific	5550200	n/a
LPS	Sigma	L4516	n/a
Cell Culture Plates 48-well	Greiner	677102	n/a
Scalpel – single use	Feather	FEA200130011	n/a
TissueLyser	Precellys 24 Dual	Cat. No. EQ03119.200.RD010.0	n/a
RNeasy (Mini) Kit	Qiagen	Cat. No. 74104	n/a
Boehringer cDNA kit	Roche Diagnostics	Cat. No. 11483188001	n/a
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific		n/a