Génération de sous-cutanée et intra-hépatique droits de carcinome hépatocellulaire xénogreffes chez la souris immunodéficientes
Summary
Xénogreffes de tumeurs humaines dans des souris immunodéficientes sont des outils précieux pour étudier la biologie du cancer. Des protocoles spécifiques pour générer des xénogreffes sous-cutanées et intra-hépatiques à partir de cellules humaines de carcinome hépatocellulaire ou des fragments de tumeur sont décrits. La régénération du foie induite par une hépatectomie partielle dans les souris receveuses sont présentées en tant que stratégie pour faciliter la prise de greffe intrahépatique.
Abstract
In vivo sur des modèles expérimentaux de carcinome hépatocellulaire (HCC) qui récapitulent la maladie humaine fournissent une plate-forme précieuse pour la recherche dans la physiopathologie de la maladie et pour l'évaluation préclinique de nouvelles thérapies. Nous présentons une variété de méthodes pour générer des sous-cutanée ou orthotopique xénogreffes de HCC humain dans des souris immunodéficientes qui pourrait être utilisé dans une variété d'applications de recherche. En mettant l'accent sur l'utilisation de tissu de tumeur primaire provenant de patients subissant une résection chirurgicale en tant que point de départ, nous décrivons la préparation de suspensions de cellules ou fragments de tumeurs de xénogreffes. Nous décrivons des techniques spécifiques pour ces tissus xénogreffe i) par voie sous cutanée, ou ii) intrahepatically, soit par implantation directe des cellules tumorales ou des fragments dans le foie, ou indirectement par l'injection des cellules dans la rate de la souris. Nous décrivons également l'utilisation d'une résection partielle du foie de la souris native au moment de la xénogreffe comme stratégie pourinduire un état de régénération active du foie chez la souris de destinataire qui peut faciliter la prise de greffe intrahépatique de cellules primaires de tumeurs humaines. Les résultats attendus de ces techniques sont illustrées. Les protocoles décrits ont été validées avec des droits primaire échantillons et les xénogreffes HCC, qui effectuent généralement moins robuste que les lignées de cellules HCC humain bien établies qui sont largement utilisés et souvent citées dans la littérature. En comparaison avec des lignées cellulaires, nous discutons des facteurs qui peuvent contribuer à la relativement faible chance de greffe de HCC primaire dans les modèles de xénotransplantation et de commenter sur les questions techniques qui peuvent influencer la cinétique de la croissance de xénogreffes. Nous proposons également des méthodes qui devraient être appliquées pour s'assurer que les xénogreffes obtenus ressemblent précisément tissus HCC mères.
Introduction
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cinquième cancer le plus répandu dans le monde et la cause la plus rapidement croissante de décès par cancer en Amérique du Nord. Le facteur de risque le plus répandu pour le HCC est la cirrhose du foie, survenant le plus souvent due à l'hépatite virale chronique, l'abus d'alcool, maladie auto-immune, ou de troubles métaboliques héréditaires 1.
En dépit de la lourde charge de morbidité imposé par HCC sur les populations à travers le monde, la physiopathologie de la HCC est relativement mal compris par rapport à d'autres cancers communs tels que colorectal, du sein ou le cancer de la prostate. Par exemple, les événements moléculaires et cellulaires spécifiques tumorigenèse route restent à être clairement définies 2. Comme la plupart des autres cancers épithéliaux solides, des approches génomiques ont révélé une hétérogénéité dans les aberrations associées à HCC 3. Un certain nombre d'études ont mis en évidence l'activité d'une variété de troubles des voies de signalisation impliquées dans la prolifération cellulaire, sursurvie, la différenciation, l'angiogenèse et 4. En outre, le rôle des cellules souches du cancer dans le CHC pathobiology reste à préciser 5.
Avec une compréhension limitée de la HCC physiopathologie, l'arsenal des traitements efficaces pour HCC est également restée relativement limitée. Patients à un stade précoce avec des tumeurs confinées au foie sont candidats à un traitement curatif par ablation de la tumeur ou une résection chirurgicale, mais les récidives sont fréquentes. Pour les patients atteints de la maladie plus avancé, chimiothérapie et la radiothérapie sont d'une efficacité limitée et sont utilisés principalement pour le contrôle de la maladie avec l'intention palliatifs 6.
De haute qualité in vivo sur des modèles expérimentaux de CHC humain fournit ainsi une plate-forme précieuse pour la recherche de base indispensable dans la physiopathologie de la HCC humaine ainsi que pour l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Par rapport à l'utilisation de lignées cellulaires ou des modèles de souris hautement définis, de xénogreffes de priMary les tumeurs humaines chez des souris immunodéficientes sont apparus comme des outils précieux pour de telles études, car ils sont capables de récapituler la maladie humaine avec une grande fidélité, tout en capturant l'hétérogénéité qui est présente dans et entre les différents patients 7,8. À cette fin, nous avons développé une variété de méthodes pour établir des xénogreffes de HCC humaines dans des souris immunodéficientes. Alors que la majorité des études publiées portant sur des xénogreffes HCC décrivent l'utilisation de lignées de cellules HCC humain bien établies à cet effet, nous nous sommes concentrés sur l'optimisation de nos analyses pour générer des xénogreffes de spécimens de HCC primaires obtenues immédiatement après la résection chirurgicale des patients.
Différentes techniques de la xénogreffe peut être nécessaire pour différentes applications de recherche. Par exemple, les xénogreffes sous-cutanées générés à partir de fragments de tumeurs sont générées rapidement, sont faciles à suivre, et peut-être plus approprié pour l'administration locale de nouvelles thérapies avec pratiquela surveillance de la réponse tumorale. Xénogreffes intra-hépatiques peuvent être plus pertinentes pour les études relatives au rôle du microenvironnement hépatique chez HCC biologie. Xénogreffes générés à partir des suspensions de cellules tumorales sont nécessaires pour l'identification et la caractérisation des sous-populations de cellules tumorales, ou pour initier expériences exigeant manipulations in vitro de cellules tumorales avant la xénotransplantation. Nous avons donc mis au point et validé les protocoles suivants pour établir des xénogreffes sous-cutanées ou intra-hépatiques à partir de suspensions de cellules ou de fragments de tumeurs provenant de spécimens de HCC humain primaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit une variété de techniques pour mettre en place sous-cutanée et intra-hépatiques xénogreffes de HCC humain dans des souris immunodéficientes qui peut être appliquée à une grande variété de questions et des dosages expérimentaux. Bien que des xénogreffes sous-cutanées ont été largement utilisés pour étudier les différents aspects de la biologie HCC, xénogreffes intra-hépatiques sont rarement décrites dans la littérature. En outre, la majorité des études décrivant l'utilisat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts canadiens de recherche en santé de la phase 1 de clinicien-chercheur Prix (AG) et une subvention de fonctionnement de la Société de recherche sur le cancer (AG). Les auteurs tiennent à remercier le Dr John Dick pour son soutien à ce projet.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| LORIS 10% PVP-I Solution | LERNA Pharma Inc. | 109-09 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100×20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″ | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4″ | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″ | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″ | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4″ | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2″ | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″ | Almedic | A17-228 |
References
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