Synthèse, Livraison cellulaire et<em> In vivo</em> Utilisation de capteurs de pH à base de dendrimères

Summary

capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L'échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées.

Abstract

Le développement d'indicateurs fluorescents représenté une révolution pour les sciences de la vie. Codées génétiquement et fluorophores synthétiques avec des capacités de détection permis la visualisation d'espèces biologiquement pertinentes avec une résolution spatiale et temporelle. Colorants synthétiques sont particulièrement intéressants grâce à leur grande accordabilité et la vaste gamme d'analytes mesurables. Cependant, ces molécules souffrent de plusieurs limitations liées à petite molécule comportement (faible solubilité, les difficultés de ciblage, souvent sans imagerie quotientométrique autorisé). Dans ce travail, nous introduisons le développement des capteurs à base de dendrimères et de présenter un mode opératoire pour la mesure du pH in vitro, dans des cellules vivantes et in vivo. Nous choisissons dendrimères comme plate-forme idéale pour nos capteurs pour leurs nombreuses propriétés souhaitables (de monodispersité, propriétés accordables, polyvalence) qui en font un échafaudage largement utilisé pour plusieurs dispositifs biomédicaux faites. La conjugaison de pH fluorescentindicateurs à l'échafaud des dendrimères ont conduit à une amélioration de leurs performances de détection. En particulier dendrimères exposition réduite fuite de cellule, un meilleur ciblage intracellulaire et permettre des mesures ratiométriques. Ces nouveaux capteurs ont été utilisés avec succès pour mesurer le pH dans la vie des cellules HeLa et in vivo dans le cerveau de la souris.

Introduction

L'utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd'hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. ¹ Une amélioration pertinente a été représentée par l'élaboration d'indicateurs de fluorescence , c'est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentration d'une entité moléculaire spécifique. pH et de calcium indicateurs en particulier ont eu un impact dramatique sur l'étude de la physiologie de la cellule en raison de l'énorme importance de H ⁺ et Ca ^{2 +} dans la biologie. ^2,3

Cependant, la plupart des colorants de détection présentent plusieurs limites intrinsèques liés à leur petite molécule comportements tels que: i) des difficultés à targeti subcellulaireng, ii) une faible solubilité dans l'eau et par conséquent une mauvaise biocompatibilité,., et iii) des fuites de cellules et donc un manque de capacité à long imagerie time-lapse ⁴ En outre, le signal de plusieurs sondes ne peut pas être corrigée en fonction de la dépendance de la concentration de colorant (non Imagerie ratiométrique) et, par conséquent, une mesure absolue dans des cellules ou in vivo n'est pas possible.

Nous avons récemment décrit une méthode simple et efficace pour surmonter ces limitations, en fonction de la conjugaison de colorants de détection sur un échafaudage de dendrimère. ⁵ Les dendrimères sont des polymères hyper-ramifiés monodispersés avec des propriétés très attrayantes pour des applications biologiques. ⁶ en particulier plusieurs architectures dendritiques ont été mis au point et utilisé pour le médicament ⁷ et la livraison de gènes. ⁸ n'est que très récemment plusieurs groupes ont commencé à explorer le potentiel de ces molécules comme échafaudage pour dispositifs de détection. ^9,10,11

Nous avons déjàdécrit une voie de synthèse facile vers la fonctionnalisation différente de polyamidoamine (PAMAM) des échafaudages à base d'esters de NHS-activées. conjugués peuvent ¹² être obtenus en une seule étape au moyen d'une dialyse en tant que purification. Fait intéressant, cette approche peut facilement être appliquée à une variété d'échafaudages dendritiques ou polymères. ^13,14

Pour atteindre les dendrimères d'imagerie ratiométrique étaient doublement marquée avec deux ensembles de colorants: i) un indicateur de pH (par exemple la fluorescéine) et ii) un fragment fluorescent indépendante du pH (par exemple la rhodamine). Cela nous a permis d'effectuer une imagerie précise du pH comme le rapport entre la fluorescéine et la rhodamine est seulement dépendante du pH et de pas plus de la concentration de la sonde. Une autre approche intéressante à ce sujet est représenté par l'utilisation de sondes à base de vie. ¹⁵ Comme la durée de vie ne dépend pas de la concentration de la sonde ces mesures n'ont pas besoin d'une correction de quotient. Cependant, lifmesures de etime nécessitent une configuration instrumentale plus complexe et leur résolution temporelle est sous-optimale pour les processus physiologiques rapides, limitant ainsi leurs applications potentielles.

Dans le but d'effectuer une imagerie intracellulaire, la sonde doit être délivré à travers la membrane plasmique dans le cytosol. Comme les dendrimères sont pas perméable en raison de leur taille et leur caractère hydrophile, la délivrance intracellulaire pourrait être réalisé par électroporation. Au moyen de cette technique, largement utilisé en biologie pour la transfection, les macromolécules marquées peuvent être exécutés de manière efficace dans des cellules d'effectuer une imagerie de haute qualité. En outre, l'électroporation avec les complications liées à dendrimère endocytose peuvent être évités en tant que les macromolécules sont directement remis au cytoplasme. Intéressant après électroporation différents dendrimères montre localisations distinctes à l'intérieur des cellules, même en l'absence de toute séquence de ciblage spécifique. ⁵ Ce passife ciblage, seulement en raison des propriétés physico-chimiques du dendrimère, pourrait être exploitée pour obtenir un pH d'imagerie spécifiques à des organites.

Imagerie ratiométrique peut être effectuée en utilisant la microscopie confocale. La fluorescéine et la rhodamine, conjugué de manière covalente à l'échafaud dendritique, ont été séparément imagées et un rapport carte pixel par pixel a été créé. Plusieurs procédures de contrôle le pH intracellulaire dans les cellules vivantes au moyen d'ionophores ont été signalés. Ionophores sont de petites molécules hydrophobes capables de transporter des ions à travers la membrane plasmique; ionophores pour ion H ^+, comme nigéricine, sont disponibles et peuvent être utilisés pour étalonner les capteurs à base de dendrimères ¹⁶ Ces mesures ont révélé une réponse linéaire de pH similaire à ce qui est observé. in vitro. Sur la base de l'étalonnage du pH intracellulaire peut être mesurée avec précision. Ces mesures ont démontré que le capteur à base de dendrimères peut être un outil précieux dans l'étude H ⁺ homeostasis dans les cellules vivantes et les processus pathologiques qui impliquent pH dysfonctionnements de régulation.

Nous avons récemment démontré que les capteurs de pH à base de dendrimères peuvent également être appliqués in vivo, effectuer une imagerie de pH dans le cerveau de souris anesthésiées. ¹⁷ En raison de l'environnement complexe des tissus vivants de haute qualité dans la détection in vivo est techniquement difficile. Ici, nous montrons une description détaillée de la procédure expérimentale in vivo pour pH imagerie avec un accent des questions cruciales à traiter pour effectuer une imagerie précise du pH dans le cerveau. Microscopie à deux photons a été utilisé pour deux raisons principales: i) l'utilisation de la lumière infrarouge permet de pallier le manque de pénétration tissulaire de la microscopie confocale norme; ii) la large absorption à deux photons de la fluorescéine et de la rhodamine permettre leur excitation simultanée d'éviter la les complications liées à l'utilisation de deux longueurs d'onde pour l'excitation. des mesures de pH dans le cerveau de la souris étaientmenées à bien; capteurs répondent que difficilement à l'hypoxie induire des changements de pH dans l'espace extracellulaire du cerveau. Ces mesures montrent que les indicateurs à base de dendrimères peuvent être utilisés avec succès pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques de pH in vivo dans un modèle animal.

Protocol

Une. Synthèse des capteurs Dans la section suivante, nous proposons une procédure pour la conjugaison d'indicateurs de pH de dendrimères PAMAM. Le même protocole peut être appliqué avec une modification minimale de substitution amine dendrimères porteurs. 5,17,13,14 dendrimères et les colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés sans autres purifications. Dissoudre le dendrimère dans du DMSO anhydre (50 uM de concentration finale). Préparer des solutions de…

Representative Results

La figure 1 montre une représentation schématique de la détection de la conjugaison de colorants différents échafaudages dendritiques. Les indicateurs qui en résultent peuvent être obtenues dans une étape de synthèse simple à partir de produits disponibles dans le commerce. Dendrimères amine portant sont mis à réagir avec des colorants NHS activés dans le DMSO et purifiés par dialyse. Ce mode opératoire général a déjà été utilisé avec succès pour le marquage de plusieurs dendrim?…

Discussion

Les étapes essentielles pour l'imagerie de pH réussie avec des capteurs à base de dendrimères sont: i) la sélection de l'échafaudage dendritique correct et le nombre d'indicateurs conjugués à elle et ii) l'optimisation du protocole de distribution de capteur dans des cellules ou in vivo.

Le mode opératoire de synthèse est relativement simple et peut être appliquée à pratiquement tous polymère hyperbranché amine portant. Les capteurs peuvent être obten…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500