Synthesis, Cellular Lieferung und<em> In-vivo-</em> Anwendung der Dendrimer-basierten pH-Sensoren

Summary

Fluoreszenz-Sensoren sind mächtige Werkzeuge in Life Science. Hier beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren und zu verwenden Dendrimerbasis Fluoreszenzsensoren auf pH in lebenden Zellen und in vivo zu messen. Die dendritische Gerüst verbessert die Eigenschaften von konjugierten Fluoreszenzfarbstoffe, die zu verbesserten Sensoreigenschaften.

Abstract

Die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren eine Revolution für die Lebenswissenschaften. Genetisch kodierte und synthetische Fluorophore mit Sensor Fähigkeiten erlaubt die Visualisierung von biologisch relevanten Spezies mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Synthetische Farbstoffe sind von besonderem Interesse, dank ihrer hohen Abstimmbarkeit und das breite Spektrum der messbaren Analyten. Allerdings sind diese Moleküle leiden mehrere Einschränkungen auf kleine Molekül Verhalten bezogen (schlechte Löslichkeit, Schwierigkeiten bei der Targeting, oft nicht ratiometrische Bildgebung erlaubt). In dieser Arbeit wird die Entwicklung der Dendrimer-basierten Sensoren führen wir und stellen ein Verfahren für die pH-Messung in vitro, in lebenden Zellen und in vivo. Wir wählen Dendrimere als ideale Plattform für unsere Sensoren für ihre viele wünschenswerte Eigenschaften (Monodispersität, einstellbaren Eigenschaften, Multivalenz), die ihnen eine weit verbreitete Gerüst für verschiedene biomedizinische Geräte gemacht. Die Konjugation von fluoreszierenden pH-WertIndikatoren für die Dendrimer-Gerüst führte zu einer Verbesserung ihrer Leistungen Erfassungs. Insbesondere Dendrimere eine verminderte Zell Leckage, verbesserte intrazelluläre Targeting und erlauben ratiometrische Messungen. Diese neuartigen Sensoren wurden erfolgreich eingesetzt, um pH-Wert in lebenden HeLa-Zellen und in vivo im Gehirn der Maus zu messen.

Introduction

Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen zu bestimmten biologisch relevanten Molekülen Etikett vollständig, wie biologische Systeme untersuchen wir verändert. Widefield und konfokale Mikroskopie für eine Echtzeit hochauflösende Visualisierung biologischer Prozesse und heute erlaubt zählen zu den beliebtesten Techniken der biologischen Ereignisse in vitro, in Zellen und in vivo zu untersuchen. ¹ Eine relevante Verbesserung wurde durch die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren dargestellt , dh Farbstoffe, deren Fluoreszenz ist abhängig von der Konzentration eines spezifischen molekularen Einheit. pH-und Calcium-Indikatoren insbesondere hatte einen dramatischen Einfluss auf die Untersuchung der Zellphysiologie aufgrund der enormen Bedeutung von H ⁺ und Ca ^{2 +-Ionen} in der Biologie. ^2,3

I) Schwierigkeiten bei der subzellulären targeti: Allerdings sind die meisten der anwesenden Erkundung mehrere Farbstoffe immanente Grenzen ihrer kleinen Molekül Verhalten wie im Zusammenhangng, ii) schlechte Löslichkeit in Wasser und damit schlechte Biokompatibilität;. iii) Zell Leckage und damit der Mangel an lang Zeitraffer-Bildgebung Fähigkeit ⁴ Darüber hinaus wird das Signal von vielen Sonden kann nicht für die Abhängigkeit von der Farbstoffkonzentration korrigiert werden (nicht ratiometrische Bildgebung), und daher ist keine absolute Messung in Zellen oder in vivo möglich.

Wir haben kürzlich eine einfache und effektive Methode, um diese Einschränkungen zu überwinden, bezogen auf die Konjugation von Sensor Farbstoffe auf einem Dendrimer-Gerüst. ⁵ monodispersen Dendrimere sind hochverzweigte Polymere mit sehr ansprechenden Eigenschaften für biologische Anwendungen. ⁶ Insbesondere mehreren dendritischen Architekturen entwickelt und verwendet Drogen ⁷ und Gen-Lieferung. ⁸ Erst in jüngster Zeit einige Gruppen begonnen, das Potenzial der Moleküle als Gerüst für die Erfassungsvorrichtungen zu erforschen. ^9,10,11

Wir haben vorherbeschrieben, einen einfachen Syntheseweg zur Funktionalisierung von verschiedenen Polyamidoamin (PAMAM)-Gerüst basierend auf NHS-Aktivester. ¹² Konjugate können in einem einzigen Schritt durch Dialyse als nur Reinigung erhalten werden. Interessanter dieser Ansatz leicht zu einer Vielzahl von dendritischen oder polymere Gerüste angewendet werden. ^13,14

Um ratiometrische Bildgebung Dendrimere zu erreichen waren doppelt markierte mit zwei Sätzen von Farbstoffe: i) ein pH-Indikator (z. B. Fluorescein) und ii) eine pH-unabhängige fluoreszierende Gruppe (dh Rhodamin). Dies erlaubte uns, eine genaue pH-Bildgebung als das Verhältnis zwischen Fluorescein und Rhodamin ist nur abhängig von dem pH-Wert und nicht mehr von der Konzentration der Sonde durchzuführen. Ein weiterer interessanter Ansatz für dieses Problem wird durch die Verwendung von Lebenszeit-basierte Sonden. Vertreten ¹⁵ Da die Lebensdauer nicht von Sondenkonzentration hängen diese Messungen müssen nicht ein ratiometrisches Korrektur. Jedoch LIFetime Messungen erfordern eine kompliziertere Instrumental Setup und deren zeitliche Auflösung für schnelle physiologische Prozesse suboptimal, was ihre Einsatzmöglichkeiten einschränkt.

Um intrazelluläre Bildgebung durchzuführen, muss die Sonde durch die Plasmamembran in das Cytosol abgegeben werden. Da die Dendrimere nicht durchlässige Membran aufgrund ihrer Größe und Hydrophilie, die intrazellulären Abgabe durch Elektroporation erreicht werden. Mit Hilfe dieser Technik, die weithin in der Biologie zur Transfektion verwendet werden, können markierte Makromoleküle effektiv in Zellen geliefert hohe Bildqualität durchzuführen. Außerdem mit der Elektroporation werden die Komplikationen Dendrimer Endozytose Zusammenhang kann vermieden werden, da die Makromoleküle werden direkt in das Zytoplasma geliefert. Interessanter nach der Elektroporation verschiedenen Dendrimere zeigt deutliche Lokalisation innerhalb der Zellen auch in Abwesenheit von spezifischen Zielsequenz. ⁵ Dieses passive Targeting, nur aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Dendrimers kann genutzt werden, um Organellen-spezifische pH-Bildgebung zu erzielen.

Ratiometrische Bildgebung können mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie werden. Fluorescein und Rhodamin, die kovalent an das dendritische Gerüst konjugiert ist, wurden separat abgebildet wird und ein Pixel-für-Pixel-Verhältnis der Karte erstellt wurde. Mehrere Verfahren zur intrazellulären pH in lebenden Zellen durch Ionophore steuern berichtet. Ionophore sind kleinen hydrophoben Molekülen, die Ionen über die Plasmamembran zu transportieren; Ionophore für H ^+-Ionen, wie Nigericin, sind verfügbar und können verwendet werden, um Dendrimer-Sensoren zu kalibrieren ^16. Diese Messungen zeigten eine lineare Reaktion auf pH-Wert ähnlich zu dem, was beobachtet. in vitro. Auf der Grundlage der Eichintrazellulären pH-Wert genau gemessen werden konnte. Diese Messungen zeigen, dass Dendrimer-basierten Sensor kann ein wertvolles Werkzeug in der Studie H ⁺ homeost seinasis in lebenden Zellen und pathologischen Prozesse, die Fehlfunktionen beinhalten pH-Regulierung.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Dendrimer-basierten pH-Sensoren können auch in vivo angewendet werden, die Durchführung pH-Bildgebung im Gehirn von betäubten Mäusen. ^17. Aufgrund der komplexen Umgebung von lebendem Gewebe eine hohe Qualität in vivo-Mess ist technisch anspruchsvoll. Hier zeigen wir eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Verfahren zur In-vivo-Bildgebung mit Schwerpunkt pH-Wert der entscheidenden Fragestellungen im Hinblick auf eine genaue pH-Bildgebung im Gehirn durchzuführen. Zwei-Photonen-Mikroskopie hat aus zwei Gründen eingesetzt: i) die Verwendung von Infrarotlicht ermöglicht es, den Mangel an Gewebepenetration von Standard-konfokale Mikroskopie überwinden, ii) die breite Zwei-Photonen-Absorption von Fluorescein und Rhodamin zulassen, dass ihre gleichzeitige Anregung der Vermeidung Komplikationen die Verwendung von zwei Wellenlängen zur Anregung stehen. pH-Messungen in Maushirn warenerfolgreich durchgeführt; Sensoren leicht auf Hypoxie reagieren induzieren Änderung des pH-Wertes im Gehirn extrazellulären Raum. Diese Messungen zeigen, dass die Dendrimer-basierten Indikatoren können erfolgreich verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderung des pH in vivo in einem Tiermodell hervorzuheben.

Protocol

1. Synthese der Sensoren Im folgenden Abschnitt stellen wir ein Verfahren für die Konjugation von pH-Indikatoren, um PAMAM-Dendrimere. Das gleiche Protokoll können mit minimalen Änderungen auf alternative Lager Amin-Dendrimere angewendet werden. 5,17,13,14 Handel erhältliche Dendrimere und Farbstoffe können ohne weitere Reinigungen verwendet werden. Löse das Dendrimer in wasserfreiem DMSO (50 &mgr; M Endkonzentration). Bereiten 10 mM Stammlösungen von Fluorescein-NHS und Tetram…

Representative Results

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Konjugation des Erfassens Farbstoffe, verschiedene dendritischen Gerüste. Die resultierenden Indikatoren können in einem einzigen Syntheseschritt aus kommerziell erhältlichen Produkten erhalten werden. Amin-tragende Dendrimere mit NHS-aktivierten Farbstoffe in DMSO umgesetzt und durch Dialyse gereinigt. Dieses allgemeine Verfahren wurde bereits erfolgreich für die Kennzeichnung von mehreren Dendrimere verwendet: i) PAMAM-Dendrimer der Generation 2, 4 u…

Discussion

Die kritischen Schritte zur erfolgreichen pH-Bildgebung mit Dendrimer-Sensoren sind: i) die Auswahl der richtigen dendritischen Gerüsts und der Anzahl von Indikatoren, die es konjugiert ist, und ii) die Optimierung der Sensorübermittlungsprotokoll in Zellen oder in vivo.

Das synthetische Verfahren ist relativ einfach und kann praktisch zu jedem Amin-tragenden hyperverzweigten Polymeren aufgebracht werden. Die Sensoren können aus kommerziell erhältlichen Dendrimere und NHS-aktivi…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500