סינתזה, משלוח נייד ו<em> בvivo</em> יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer

Summary

חיישני הקרינה הם כלים רבי עוצמה בתחום מדעי חיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה לסנתז ולהשתמש בחיישני ניאון מבוסס dendrimer למדוד pH בתאים חיים וin vivo. הפיגום הדנדריטים משפר את תכונותיהם של צבעי ניאון מצומדות המובילים למאפייני חישה משופרים.

Abstract

הפיתוח של אינדיקטורים ניאון ייצג מהפכה למדעי חיים. מבחינה גנטית מקודד וfluorophores הסינתטי עם יכולות חישה אפשר להדמיה של מינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. צבעים סינטטיים הם של עניין מיוחד הודות לtunability הגבוה שלהם ואת מגוון הרחב של analytes למדידה. עם זאת, מולקולות אלה סובלים מספר מגבלות הקשורות להתנהגות מולקולה קטנה (מסיסות ירודה, קשיים במיקוד, לעתים קרובות אין הדמיה ratiometric מותרת). בעבודה זו אנו מציגים את הפיתוח של חיישנים מבוססי dendrimer ולהציג את הליך למדידת רמת חומציות במבחנה, בתאים חיים וin vivo. אנחנו בוחרים dendrimers כפלטפורמה אידיאלית עבור החיישנים שלנו עבור רבים תכונותיהם רצויות (monodispersity, תכונות מתכונן, multivalency) שגרמו להם פיגום בשימוש נרחב לכמה מכשירים ביו. נטיה של pH הניאוןאינדיקטורים לפיגום dendrimer הובילו לשיפור של הופעות החישה שלהם. בפרט תערוכת dendrimers הקטינה זליגת תא, מיקוד תאיים משופר ויאפשר מדידות ratiometric. חיישנים אלה רומן הועסקו בהצלחה למדידת רמת חומציות בתאים חי הלה ובחי במוח עכבר.

Introduction

השימוש במולקולות ניאון לתייג מולקולות ביולוגיות רלוונטיות ספציפיות השתנתה לחלוטין את הדרך בה אנו לומדים במערכות ביולוגיות. Widefield ומיקרוסקופיה confocal אפשרה להדמיה בזמן אמת ברזולוציה הגבוהה של תהליכים ביולוגיים וכיום הם בין הטכניקות הפופולריות ביותר ללמוד אירועים ביולוגיים במבחנה, בתאי in vivo. ¹ שיפור רלוונטי היה מיוצג על ידי הפיתוח של אינדיקטורים הקרינה , צבעים כלומר הקרינה שתלויה בריכוזה של ישות מולקולרית ספציפית. מדדי ה-pH וסידן בפרט היו השפעה דרמטית על המחקר של פיזיולוגיה של תא עקב הרלוונטיות עצומות של H ⁺ ו Ca ^{2 +} יונים בביולוגיה. ^2,3

עם זאת, רוב צבעי החישה הנוכחיים כמה מגבלות פנימיות הקשורים להתנהגות המולקולה הקטנה שלהם, כגון: א) קשיים בtargeti subcellularng; ii) מסיסות עניות במים וכתוצאה מכך biocompatibility עניים;. וiii) דליפת תא ובכך חוסר היכולת הארוכה זמן לשגות הדמיה ⁴ יתר על כן, את האות של בדיקות רבות לא ניתן לתקן עבור התלות בריכוז הצבע (שאינה ההדמיה ratiometric) ולכן, מדידה מוחלטת בתאים או בvivo היא לא אפשרית.

לאחרונה תוארו המתודולוגיה פשוטה ויעילה כדי להתגבר על המגבלות האלה, המבוססות על נטיה של צבעי חישה על פיגום dendrimer. ⁵ Dendrimers הם פולימרים hyperbranched monodisperse עם מאפיינים מאוד מושך עבור יישומים ביולוגיים. ⁶ בפרט כמה ארכיטקטורות הדנדריטים פותחו ומשמשות לתרופה ⁷ ומסירת גן. ⁸ רק לאחרונה מספר קבוצות התחילו לחקור את הפוטנציאל של מולקולות אלה כפיגום למכשירי חישה. ^9,10,11

אנחנו בעברתאר מסלול קל סינטטי כלפי functionalization של polyamidoamine שונה פיגומים (Pamam) המבוסס על אסטרים הופעלו-NHS. ניתן להשיג ¹² Conjugates בשלב אחד בדרך של דיאליזה כטיהור בלבד. מעניין גישה זו יכולה בקלות להיות מיושמת על מגוון רחב של פיגומים הדנדריטים או פולימרים. ^13,14

כדי להשיג dendrimers ההדמיה ratiometric היו עם שני סטים של צבעים שכותרתו כפולים: א) אינדיקטור pH (כלומר העמסה) וii) מחצית pH עצמאי ניאון (כלומר rhodamine). זה אפשר לנו לבצע הדמיה מדויקת של pH כיחס בין ההעמסה וrhodamine הוא רק תלוי בחומציות ולא יותר על הריכוז של החללית. גישה מעניינת נוספת לנושא זה מיוצגת על ידי השימוש בבדיקות המבוססים על חייו. ¹⁵ כחיים אינם תלויות בריכוז בדיקה מדידות אלה לא צריכים תיקון ratiometric. עם זאת, lifמדידות etime דורשות התקנת אינסטרומנטלי מסובכת יותר והרזולוציה של הזמן שלהם היא תת אופטימלית לתהליכים פיסיולוגיים במהירות, ובכך להגביל היישומים הפוטנציאליים שלהם.

על מנת לבצע הדמיה תאית, החללית צריכה להיות מועברת על פני קרום הפלזמה לתוך cytosol. כdendrimers לא קרום חדיר בשל הגודל וhydrophilicity, משלוח תאיים יכול להיות מושגת באמצעות electroporation. באמצעות טכניקה זו, בשימוש נרחב בביולוגיה לtransfection, מקרומולקולות שכותרתו יכולה להיות מועברות בצורה יעילה לתאים לבצע הדמיה באיכות גבוהה. יתר על כן, עם electroporation ניתן להימנע מסיבוכים הקשורים לאנדוציטוזה dendrimer כמקרומולקולות מועברות ישירות לציטופלסמה. מעניין אחרי dendrimers שונה electroporation תערוכות מגוירים מובחן בתוך התאים גם בהיעדרו של כל רצף מיקוד ספציפי. ⁵ passiv זהדואר מיקוד, רק בשל מאפייני physicochemical של dendrimer, ניתן לנצל כדי להשיג הדמיה pH אברון הספציפי.

הדמיה ratiometric יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ההעמסה וrhodamine, קוולנטית מצומדת לפיגום הדנדריטים, היו צילמו בנפרד ומפת יחס פיקסל אחר פיקסל נוצרה. כמה נהלים כדי לשלוט ברמת חומציות תוך תאית בתאים חיים באמצעות יונופורים דווחו. יונופורים הם מולקולות קטנות הידרופובי מסוגלים להעביר יונים על פני קרום הפלזמה; יונופורים עבור H ⁺ יון, כגון nigericin, זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכייל את החיישנים מבוססי dendrimer ¹⁶ מדידות אלה חשפו תגובה ליניארי ל-pH באופן דומה למה שנצפה. במבחנה. על בסיס ה-pH תאית כיול ניתן היה למדוד באופן מדויק. מדידות אלה הראו כי חיישן מבוסס dendrimer יכול להיות כלי רב ערך במחקר H ⁺ homeostאס בתאים חיים ובתהליכים פתולוגיים שכרוך בתקלות ויסות רמת חומציות.

לאחרונה הוכיחו כי יכולים להיות מיושמים גם חיישני pH מבוסס dendrimer in vivo, ביצוע ההדמיה pH במוח של עכברים מורדמים. ¹⁷ בשל הסביבה המורכבת של רקמות חיות באיכות גבוהה בחישת vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית. כאן אנו מראים תיאור מפורט של ההליך ניסיוני להדמית pH in vivo עם דגש של הסוגיות מכריעות לטפל לבצע הדמיה מדויקת של pH במוח. שני הפוטונים במיקרוסקופ כבר מועסק משתי סיבות עיקריות: א) השימוש באור אינפרא אדום מאפשר להתגבר על חוסר חדירה לרקמות של מיקרוסקופיה confocal הסטנדרטי; ii) את ספיגת שני פוטונים הרחב של העמסה וrhodamine מאפשרת העירור בו זמנית שלהם הימנעות סיבוכים הקשורים לשימוש בשני אורכי גל לעירור. מדידות pH במוח עכבר היוביצע בהצלחה החוצה; חיישנים בקלות להגיב להיפוקסיה לגרום לשינוי של ה-pH במרחב תאי במוח. מדידות אלו מראות כי אינדיקטורים המבוסס על dendrimer יכולים לשמש בהצלחה כדי להדגיש את השינוי פיסיולוגי ופתולוגיים של pH in vivo במודל חיה.

Protocol

1. סינתזה של חיישנים בסעיף הבא שאנו מספקים להליך נטיה של מדדי ה-pH ל dendrimers Pamam. אותו הפרוטוקול יכול להיות מיושם עם שינויים מינימאליים לdendrimers אמין נושאות חלופיות. 5,17,13,14 dendrimers וצבעים ניתן להשיג בחנויות ניתן להשתמש ל?…

Representative Results

איור 1 מציג ייצוג סכמטי של נטיה של חישת צבעים לפיגומים הדנדריטים שונים. ניתן להשיג אינדיקטורים וכתוצאה מכך צעד סינטטי קל אחד ממוצרים זמינים מסחרי. dendrimers אמין נושאות הם הגיבו בצבעים הופעלו-NHS בDMSO ומטוהר על ידי דיאליזה. נוהל כללי זו כבר שימש בהצלחה עבור תיוג של …

Discussion

השלבים הקריטיים עבור הדמיה pH מוצלחת עם חיישנים מבוססי dendrimer הם: א) הבחירה של פיגום הדנדריטים הנכון ומספר אינדיקטורים מצומדת אליו וii) אופטימיזציה של פרוטוקול מסירה חיישן בתאים או בגוף חי.

ההליך הסינתטי הוא קל למדי וניתן ליישם …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500