संश्लेषण, वितरण सेलुलर और<em> में विवो</em> Dendrimer आधारित पीएच सेंसर का आवेदन
Summary
प्रतिदीप्ति सेंसर जीवन विज्ञान के क्षेत्र में शक्तिशाली उपकरण हैं. यहाँ हम synthesize और जीवित कोशिकाओं में और vivo में पीएच मापने के लिए Dendrimer आधारित फ्लोरोसेंट सेंसर का उपयोग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन. वृक्ष के समान पाड़ सुधार संवेदन गुण के लिए अग्रणी संयुग्मित फ्लोरोसेंट रंगों के गुणों को बढ़ाता है.
Abstract
फ्लोरोसेंट संकेतक का विकास जीवन विज्ञान के लिए एक क्रांति का प्रतिनिधित्व किया. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग और संवेदन क्षमताओं के साथ सिंथेटिक fluorophores उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक प्रजातियों के दृश्य की अनुमति दी. सिंथेटिक रंगों उनके उच्च tunability और measureable analytes की विस्तृत श्रृंखला के लिए विशेष रुचि धन्यवाद के हैं. हालांकि, इन अणुओं (गरीब विलेयता, लक्ष्यीकरण में कठिनाइयों, अक्सर कोई ratiometric इमेजिंग की अनुमति है) छोटे अणु व्यवहार से संबंधित कई सीमाएं पीड़ित हैं. इस काम में हम Dendrimer आधारित सेंसर का विकास शुरू करने और जीवित कोशिकाओं में और vivo में इन विट्रो में पीएच माप के लिए एक प्रक्रिया मौजूद है. हम उन्हें कई जैव चिकित्सा उपकरणों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल पाड़ कर दिया है कि उनके कई वांछनीय गुणों (monodispersity, tunable गुण, multivalency) के लिए हमारे सेंसर के लिए आदर्श मंच के रूप में dendrimers चुनें. फ्लोरोसेंट पीएच के विकारdendrimer पाड़ के लिए संकेतक उनके संवेदन प्रदर्शन का एक वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया. विशेष रूप से dendrimers प्रदर्शनी सेल रिसाव, सुधार intracellular लक्ष्यीकरण और ratiometric माप की अनुमति कम कर दिया. ये उपन्यास सेंसर सफलतापूर्वक HELA कोशिकाओं में रहने वाले और माउस मस्तिष्क में vivo में पीएच मापने के लिए कार्यरत थे.
Introduction
विशिष्ट जैविक प्रासंगिक अणुओं लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट अणु का उपयोग पूरी तरह से हम जैविक प्रणालियों का अध्ययन का तरीका बदल गया है. Widefield और आजकल एक वास्तविक समय उच्च संकल्प जैविक प्रक्रियाओं के दृश्य और के लिए अनुमति दी confocal माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं में और vivo में इन विट्रो में जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक में हैं. 1 एक प्रासंगिक सुधार प्रतिदीप्ति संकेतकों के विकास के द्वारा प्रस्तुत किया गया था , जिसका प्रतिदीप्ति एक विशिष्ट आणविक इकाई की एकाग्रता पर निर्भर है यानी रंगों. विशेष रूप से पीएच और कैल्शियम संकेतक कारण एच + और सीए जीव विज्ञान में 2 + आयनों की भारी प्रासंगिकता को सेल शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ा. 2,3
Subcellular targeti में मैं) कठिनाइयों: हालांकि, वर्तमान संवेदन रंगों के सबसे कई आंतरिक सीमाओं जैसे उनके छोटे अणु व्यवहार से संबंधितएनजी, पानी और फलस्वरूप गरीब biocompatibility में द्वितीय) गरीब विलेयता;. और III) सेल रिसाव और लंबे समय चूक इमेजिंग क्षमता 4 के इस प्रकार कमी इसके अलावा, कई जांच के संकेत डाई एकाग्रता पर निर्भरता के लिए सही नहीं किया जा सकता है (गैर ratiometric इमेजिंग) और इसलिए, कोशिकाओं में या विवो में एक निरपेक्ष माप संभव नहीं है.
हमने हाल ही में एक dendrimer पाड़ पर संवेदन रंगों के संयोजन पर आधारित, इन सीमाओं को पार करने के लिए एक सरल और प्रभावी पद्धति का वर्णन किया. 5 Dendrimers जैविक अनुप्रयोगों के लिए बहुत आकर्षक गुणों के साथ monodisperse hyperbranched पॉलिमर हैं. विशेष रूप से 6 कई वृक्ष के समान आर्किटेक्चर विकसित और इस्तेमाल किया गया है दवा 7 और जीन डिलीवरी के लिए. 8 बहुत ही हाल ही में कई समूहों संवेदी उपकरणों के लिए पाड़ के रूप में इन अणुओं की क्षमता का पता लगाने के लिए शुरू कर दिया. 9,10,11
हम पहलेएनएचएस सक्रिय एस्टर के आधार पर अलग polyamidoamine की functionalization की दिशा में एक आसान सिंथेटिक मार्ग (PAMAM) scaffolds का वर्णन किया. 12 Conjugates केवल शुद्धि के रूप में डायलिसिस के माध्यम से एक भी कदम में प्राप्त किया जा सकता है. दिलचस्प बात यह है कि इस दृष्टिकोण को आसानी से वृक्ष के समान या polymeric scaffolds की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है. 13,14
मैं) एक पीएच सूचक (यानी fluorescein) और द्वितीय) एक पीएच स्वतंत्र फ्लोरोसेंट आधा भाग (यानी rhodamine): ratiometric इमेजिंग dendrimers प्राप्त करने के लिए डबल लेबल रंगों के दो सेट के साथ थे. यह हमें fluorescein और rhodamine के बीच अनुपात पीएच पर ही निर्भर है और कोई और अधिक जांच की एकाग्रता पर ही सही पीएच इमेजिंग प्रदर्शन करने की अनुमति दी. जीवन भर इन मापों एक ratiometric सुधार की जरूरत नहीं है जांच एकाग्रता पर निर्भर नहीं करता है के रूप में इस मुद्दे पर एक और दिलचस्प दृष्टिकोण जीवनकाल आधारित जांच का उपयोग. 15 का प्रतिनिधित्व करती है. हालांकि, lifEtime माप एक अधिक जटिल भूमिका निभाई सेटअप की आवश्यकता होती है और उनके अस्थायी समाधान इस तरह उनके संभावित अनुप्रयोगों सीमित तेजी से शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए उप इष्टतम है.
Intracellular इमेजिंग प्रदर्शन करने के क्रम में, जांच cytosol में प्लाज्मा झिल्ली भर में वितरित किए जाने की जरूरत है. Dendrimers की वजह से उनके आकार और hydrophilicity को पारगम्य झिल्ली नहीं कर रहे हैं, intracellular वितरण electroporation के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. व्यापक रूप से अभिकर्मक के लिए जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है कि इस तकनीक के माध्यम से, लेबल अणुओं को प्रभावी ढंग से उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए कोशिकाओं में दिया जा सकता है. बड़े अणुओं सीधे cytoplasm के लिए दिया जाता है इसके अलावा, electroporation के साथ dendrimer endocytosis से संबंधित जटिलताओं से बचा जा सकता है. Electroporation अलग dendrimers भी किसी भी विशिष्ट लक्षित अनुक्रम के अभाव में कोशिकाओं के अंदर अलग localizations पता चलता दिलचस्प के बाद. 5 यह passivई कारण ही dendrimer के भौतिक गुणों को निशाना, organelle विशेष पीएच इमेजिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Ratiometric इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है. Covalently वृक्ष के समान पाड़ संयुग्मित fluorescein और rhodamine, अलग imaged थे और एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल अनुपात नक्शा बनाया गया था. Ionophores के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में intracellular पीएच को नियंत्रित करने के लिए कई प्रक्रियाओं की सूचना मिली. Ionophores प्लाज्मा झिल्ली भर आयनों परिवहन करने में सक्षम छोटे हाइड्रोफोबिक अणु होते हैं, एच + आयन के लिए ionophores, ऐसे nigericin के रूप में उपलब्ध हैं, और Dendrimer आधारित सेंसर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 16 इन मापों मनाया क्या करने के लिए इसी पीएच को एक रेखीय प्रतिक्रिया का पता चला. इन विट्रो में. अंशांकन intracellular पीएच के आधार पर सही मापा जा सकता है. इन मापों Dendrimer आधारित सेंसर अध्ययन एच + homeost में एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है कि प्रदर्शनASIS जीवित कोशिकाओं और रोग प्रक्रियाओं में पीएच विनियमन malfunctions शामिल है.
हमने हाल ही में Dendrimer आधारित पीएच सेंसर भी anesthetized चूहों के मस्तिष्क में पीएच इमेजिंग प्रदर्शन, विवो में लागू किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया. 17 कारण विवो संवेदन में एक उच्च गुणवत्ता वाले तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है जीवित ऊतकों की जटिल पर्यावरण के लिए. यहाँ हम मस्तिष्क में एक सटीक पीएच इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए संबोधित किया जाना महत्वपूर्ण मुद्दों के जोर देने के साथ vivo में पीएच इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विस्तृत विवरण दिखा. दो photon माइक्रोस्कोपी दो मुख्य कारणों के लिए नियोजित किया गया है: मैं) अवरक्त प्रकाश का उपयोग मानक confocal माइक्रोस्कोपी के ऊतक प्रवेश की कमी को दूर करने के लिए अनुमति देता है; द्वितीय) fluorescein और rhodamine की व्यापक दो photon अवशोषण उनके साथ उत्तेजना से बचने की अनुमति उत्तेजना के लिए दो तरंग दैर्ध्य के उपयोग से संबंधित जटिलताओं. माउस मस्तिष्क में पीएच माप थेसफलतापूर्वक बाहर किया, सेंसर आसानी मस्तिष्क बाह्य अंतरिक्ष में पीएच के परिवर्तन के लिए प्रेरित हाइपोक्सिया का जवाब. इन मापों Dendrimer आधारित संकेतक सफलतापूर्वक एक पशु मॉडल में vivo में पीएच की शारीरिक और रोग परिवर्तन को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrimer आधारित सेंसर के साथ सफल पीएच इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: मैं) सही वृक्ष के समान पाड़ का चयन और यह संयुग्मित संकेतक की संख्या और कोशिकाओं में या विवो में सेंसर वितरण प्रोटोकॉल के द्वि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Isja डे Feijter और मैट बेकर के साथ उपयोगी चर्चा कृतज्ञता स्वीकार कर रहे हैं.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
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