capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L'échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement d'indicateurs fluorescents représenté une révolution pour les sciences de la vie. Codées génétiquement et fluorophores synthétiques avec des capacités de détection permis la visualisation d'espèces biologiquement pertinentes avec une résolution spatiale et temporelle. Colorants synthétiques sont particulièrement intéressants grâce à leur grande accordabilité et la vaste gamme d'analytes mesurables. Cependant, ces molécules souffrent de plusieurs limitations liées à petite molécule comportement (faible solubilité, les difficultés de ciblage, souvent sans imagerie quotientométrique autorisé). Dans ce travail, nous introduisons le développement des capteurs à base de dendrimères et de présenter un mode opératoire pour la mesure du pH in vitro, dans des cellules vivantes et in vivo. Nous choisissons dendrimères comme plate-forme idéale pour nos capteurs pour leurs nombreuses propriétés souhaitables (de monodispersité, propriétés accordables, polyvalence) qui en font un échafaudage largement utilisé pour plusieurs dispositifs biomédicaux faites. La conjugaison de pH fluorescentindicateurs à l'échafaud des dendrimères ont conduit à une amélioration de leurs performances de détection. En particulier dendrimères exposition réduite fuite de cellule, un meilleur ciblage intracellulaire et permettre des mesures ratiométriques. Ces nouveaux capteurs ont été utilisés avec succès pour mesurer le pH dans la vie des cellules HeLa et in vivo dans le cerveau de la souris.
Introduction
L'utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd'hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. 1 Une amélioration pertinente a été représentée par l'élaboration d'indicateurs de fluorescence , c'est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentratio....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Une. Synthèse des capteurs
- Dans la section suivante, nous proposons une procédure pour la conjugaison d'indicateurs de pH de dendrimères PAMAM. Le même protocole peut être appliqué avec une modification minimale de substitution amine dendrimères porteurs. 5,17,13,14 dendrimères et les colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés sans autres purifications.
- Dissoudre le dendrimère dans du DMSO anhydre (50 uM de concentration finale). Préparer des solutions de 10 mM d'achat d'actions de la fluorescéine NHS et tétraméthyl-rhodamine-NHS (TMR) dans DMSO anhydre.
- Ajouter à la solution de dendrimère la qua....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La figure 1 montre une représentation schématique de la détection de la conjugaison de colorants différents échafaudages dendritiques. Les indicateurs qui en résultent peuvent être obtenues dans une étape de synthèse simple à partir de produits disponibles dans le commerce. Dendrimères amine portant sont mis à réagir avec des colorants NHS activés dans le DMSO et purifiés par dialyse. Ce mode opératoire général a déjà été utilisé avec succès pour le marquage de plusieurs dendrimères: i) la génération de.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les étapes essentielles pour l'imagerie de pH réussie avec des capteurs à base de dendrimères sont: i) la sélection de l'échafaudage dendritique correct et le nombre d'indicateurs conjugués à elle et ii) l'optimisation du protocole de distribution de capteur dans des cellules ou in vivo.
Le mode opératoire de synthèse est relativement simple et peut être appliquée à pratiquement tous polymère hyperbranché amine portant. Les capteurs peuvent être obtenus à partir des .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Par défaut: les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Discussions utiles avec Isja de Feijter et Matt Baker grandement appréciée.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescéine NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Uréthane | Sigma-Aldrich | U2500 |
Références
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators w....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
