Sintesi, Consegna Cellulare e<em> In vivo</em> Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero

Summary

I sensori di fluorescenza sono strumenti potenti nella scienza della vita. Qui si descrive un metodo per sintetizzare ed utilizzare sensori fluorescenti basato dendrimero-per misurare il pH nelle cellule viventi e in vivo. L'impalcatura dendritiche esalta le proprietà dei coloranti fluorescenti coniugati che conducono al miglioramento delle caratteristiche di rilevamento.

Abstract

Lo sviluppo di indicatori fluorescenti ha rappresentato una rivoluzione per le scienze della vita. Geneticamente codificato e fluorofori sintetici con capacità di rilevamento ha permesso la visualizzazione di specie biologicamente rilevanti con alta risoluzione spaziale e temporale. Coloranti sintetici sono di particolare interesse grazie alla loro elevata sintonizzabilità e la vasta gamma di analiti misurabili. Tuttavia, queste molecole soffrono di alcune limitazioni legate alla piccola comportamento della molecola (scarsa solubilità, difficoltà di targeting, spesso senza immagini ratiometric consentito). In questo lavoro si introduce lo sviluppo di sensori basati dendrimero e presentiamo una procedura per la misurazione del pH in vitro, in cellule viventi e in vivo. Abbiamo scelto dendrimeri come piattaforma ideale per i nostri sensori per le loro numerose proprietà desiderabili (monodispersity, proprietà sintonizzabili, multivalenza) che li un'impalcatura ampiamente utilizzato per diversi dispositivi biomedici fatte. La coniugazione di pH fluorescenteIndicatori al patibolo dendrimer portato ad un miglioramento delle loro prestazioni di rilevamento. In particolare dendrimeri mostre ridotto la perdita delle cellule, migliore il targeting intracellulare e permettere misurazioni raziometriche. Questi nuovi sensori sono stati impiegati con successo per misurare il pH nel vivere cellule HeLa e in vivo nel cervello di topo.

Introduction

L'utilizzo di molecole fluorescenti per etichettare specifiche molecole biologicamente rilevanti ha completamente cambiato il nostro modo di studiare sistemi biologici. Widefield e microscopia confocale consentito in tempo reale ad alta risoluzione visualizzazione dei processi biologici e oggi sono tra le tecniche più popolari per studiare eventi biologici in vitro, in cellule e in vivo. ¹ un miglioramento rilevante era rappresentata dallo sviluppo di indicatori di fluorescenza , cioè coloranti cui fluorescenza dipende dalla concentrazione di una entità molecolare specifico. pH e calcio indicatori, in particolare, hanno avuto un impatto drammatico sullo studio della fisiologia cellulare a causa della enorme rilevanza di ^{2 +} ioni in biologia H ⁺ e Ca. ^2,3

Tuttavia, la maggior parte dei coloranti sensibili presenti diversi limiti intrinseci legati alla loro piccola molecola comportamento quali: i) difficoltà targeti subcellulareng; ii) scarsa solubilità in acqua e conseguente scarsa biocompatibilità;. e iii) perdite cellulare e quindi la mancanza di capacità time-lapse imaging lungo ⁴ Inoltre, il segnale di molte sonde può non essere corretta per la dipendenza dalla concentrazione di colorante (non- l'imaging raziometrico) e quindi, una misura assoluta in cellule o in vivo non è possibile.

Recentemente abbiamo descritto un metodo semplice ed efficace per superare queste limitazioni, basato sulla coniugazione di coloranti sensibili alla pressione su un ponteggio dendrimero. ⁵ dendrimeri sono polimeri hyperbranched monodisperse con proprietà molto interessanti per applicazioni biologiche. ⁶ In particolare diverse architetture dendritiche sono stati sviluppati e utilizzati per la droga ⁷ e la consegna del gene. ⁸ Solo molto recentemente alcuni gruppi hanno cominciato a esplorare le potenzialità di queste molecole come impalcatura per i dispositivi di rilevamento. ^9,10,11

Abbiamo precedentementedescritto una via sintetica semplice verso la funzionalizzazione di diversa polyamidoamine (PAMAM) scaffold a base di esteri NHS-attivati. Coniugati ¹² possono essere ottenuti in un unico passaggio mediante dialisi come soltanto la purificazione. È interessante notare che questo approccio può essere facilmente applicata ad una varietà di scaffold dendritiche o polimerici. ^13,14

Per raggiungere dendrimeri di imaging raziometrici erano doppio marcato con due serie di coloranti: i) un indicatore di pH (cioè fluoresceina) e ii) una porzione fluorescente pH-indipendente (cioè rodamina). Questo ha permesso di effettuare l'imaging pH accurate come rapporto tra fluoresceina e rodamina dipende solo dal pH e non più sulla concentrazione della sonda. Un altro approccio interessante per questo problema è rappresentata dall'utilizzo di sonde a vita basata. ¹⁵ Come la vita non dipende concentrazione sonda queste misurazioni non necessitano di correzione raziometrico. Tuttavia, LIFmisure Etime richiedono una più complessa configurazione strumentale e la loro risoluzione temporale è sub-ottimale per i processi fisiologici veloci, limitando così le loro potenziali applicazioni.

Al fine di effettuare l'imaging intracellulare, la sonda deve essere consegnato attraverso la membrana plasmatica nel citosol. Poiché i dendrimeri non vengono membrana permeabile causa delle loro dimensioni e idrofilia, consegna intracellulare potrebbe avvenire tramite elettroporazione. Mediante questa tecnica, ampiamente utilizzata in biologia per la trasfezione, macromolecole etichettati possono essere efficacemente consegnati in cellule effettuare immagini di alta qualità. Inoltre, con elettroporazione le complicazioni legate al dendrimero endocitosi possono essere evitate le macromolecole sono direttamente consegnati al citoplasma. È interessante notare che dopo l'elettroporazione diversi dendrimeri mostra localizzazioni distinte all'interno delle cellule anche in assenza di qualsiasi sequenza di targeting specifico. ⁵ Questo passivoe rivolti, solo a causa delle proprietà fisico-chimiche del dendrimero, può essere sfruttata per realizzare specifici organello pH imaging.

Immagini Raziometrico può essere effettuata utilizzando la microscopia confocale. Fluoresceina e rodamina, covalentemente coniugato con l'impalcatura dendritica, sono stati ripresi separatamente e un pixel per pixel rapporto mappa è stata creata. Sono stati segnalati diversi procedure di controllo di pH intracellulare in cellule viventi mediante ionofori. Ionofori sono piccole molecole idrofobiche in grado di trasportare ioni attraverso la membrana plasmatica; Ionofori per ione H ^+, come nigericin, sono disponibili e possono essere usati per calibrare sensori basati ^{dendrimero-16} Queste misurazioni hanno rivelato una risposta lineare a pH analogamente a quanto osservato. in vitro. Sulla base del pH intracellulare calibrazione potrebbe essere misurata con precisione. Queste misure hanno dimostrato che il sensore basato dendrimer, può essere uno strumento prezioso per lo studio H ⁺ homeostAsis nelle cellule viventi e dei processi patologici che coinvolgono pH regolazione malfunzionamenti.

Abbiamo recentemente dimostrato che i sensori di pH basato dendrimero possono essere applicate anche in vivo, eseguendo l'imaging pH nel cervello di topi anestetizzati. ¹⁷ causa dell'ambiente complesso di tessuti viventi una qualità elevata rilevamento vivo è tecnicamente difficile. Qui vi mostriamo una descrizione dettagliata della procedura sperimentale in vivo pH di imaging con enfasi delle questioni cruciali da affrontare per eseguire un accurato immagini pH nel cervello. Microscopia a due fotoni è stato impiegato per due motivi principali: i) l'uso di luce infrarossa permette di superare la mancanza di penetrazione nei tessuti della microscopia confocale norma; ii) l'ampio assorbimento a due fotoni di fluoresceina e rodamina consentire la loro eccitazione simultanea evitando l' complicanze legate all'uso di due lunghezze d'onda di eccitazione. misure di pH nel cervello di topo sono statieffettuate con successo; sensori prontamente rispondono all'ipossia provocare cambiamenti di pH nello spazio extracellulare cervello. Queste misurazioni mostrano che gli indicatori basato dendrimero possono essere usati con successo per evidenziare cambiamenti fisiologici e patologici del pH in vivo in un modello animale.

Protocol

1. Sintesi dei sensori Nella sezione seguente forniamo una procedura per la coniugazione di indicatori di pH a dendrimeri PAMAM. Lo stesso protocollo può essere applicato con modifiche minime al dendrimeri ammina-cuscinetto alternativi. 5,17,13,14 dendrimeri e coloranti disponibili in commercio possono essere utilizzati senza ulteriori purificazioni. Sciogliere il dendrimer in DMSO anidro (concentrazione finale di 50 micron). Preparare soluzioni 10mM stock di fluoresceina NHS e tetrameti…

Representative Results

La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica della coniugazione di rilevamento coloranti differenti scaffold dendritiche. Gli indicatori risultanti possono essere ottenuti in un solo passo sintetica facile da prodotti commercialmente disponibili. Dendrimeri ammina cuscinetti vengono fatti reagire con coloranti NHS attivati ​​in DMSO e purificati mediante dialisi. Tale procedura generale è già stato utilizzato con successo per l'etichettatura di alcuni dendrimeri: i) generazione PAMAM den…

Discussion

Le fasi critiche per l'imaging pH con sensori basati dendrimero-sono: i) la selezione del ponteggio dendritica corretta e il numero di indicatori coniugati ad esso e ii) l'ottimizzazione di protocollo di recapito sensore in cellule o in vivo.

La procedura di sintesi è abbastanza semplice e può essere applicato praticamente ad ogni polimero hyperbranched ammina-cuscinetto. I sensori possono essere ottenuti da dendrimeri disponibili in commercio e coloranti NHS-attivati ​?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500