합성, 세포 전달 및<em> 생체 내</em> 덴드리머 기반 pH 센서의 응용 프로그램
Summary
형광 센서는 생명 과학에있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 합성하고 살아있는 세포 및 생체 내에서의 pH를 측정하는 덴드리머 계 형광 센서를 사용하는 방법을 설명한다. 수지상 발판이 개선 감지 특성에 이르는 복합 형광 염료의 특성을 향상시킨다.
Abstract
형광 지표의 개발은 생명 과학 분야의 혁명을 표현. 유전자 인코딩 감지 능력을 가진 합성 형광체는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 생물학적으로 중요한 종의 시각화를 허용했다. 합성 염료는 높은 조정 기능과 측정 가능한 분석의 다양한 분야에 특별한 관심 덕분이다. 그러나 이러한 분자 (용해도가 타겟팅에 어려움이 종종 더 비율 계량 영상은 허용되지 않습니다) 작은 분자 행동과 관련된 몇 가지 제한 사항을 겪고 있습니다. 본 연구에서 우리는 덴드리머 기반 센서의 개발을 소개하고 살아있는 세포 및 생체 내에서, 시험관 내에서 pH를 측정하는 절차를 제시한다. 우리는 그 몇 가지 생물 의학 장치에 널리 사용되는 발판 만든 그들의 많은 바람직한 특성 (단 분산, 조정 가능한 속성, multivalency)에 대한 우리의 센서를위한 이상적인 플랫폼으로 덴드리머를 선택합니다. 형광의 pH의 활용덴드리머의 발판을 지표들이 감지 성능의 향상되었다. 특히 덴드리머 전시 세포 누출, 개선 된 세포 타겟팅 및 비율 계량 측정을 할 수 감소. 이 새로운 센서는 성공적으로 HeLa 세포 생활에 마우스 뇌의 생체 내에서의 pH를 측정하기 위해 사용되었다.
Introduction
특정 생물학적으로 중요한 분자를 라벨에 형광 분자의 사용은 완전히 우리가 생물 학적 시스템을 연구하는 방법을 변경했습니다. 위드 요즘 실시간 고해상도 생물학적 과정의 시각화를 허용 공 초점 현미경 세포와 생체 내에서 체외에서 생체 이벤트를 공부하는 가장 인기있는 방법 중 하나입니다. 1 관련 개선이 형광 지표의 개발에 의해 표현 된 누구의 형광 특정 분자 기업의 농도에 따라 달라집니다 즉, 염료. 특히 pH와 칼슘 지표로 인해 H + 및 CA 생물학 2 + 이온의 거대한 관련성에 세포 생리학의 연구에 큰 영향을 미쳤다. 2,3
세포 내 targeti에있는 I)의 어려움 그러나, 현재 감지 염료의 대부분의 몇 가지 고유 제한과 같은 자신의 작은 분자 동작과 관련된NG, 물, 결과적으로 가난한 생체 적합성 II) 용해도;. 및 III) 세포의 누출과 긴 시간 경과 이미징 능력 4, 따라서 부족 또한, 다양한 프로브의 신호는 염료 농도에 의존 보정 할 수없는 (비 비율 계량 영상) 때문에, 세포 또는 생체 내에서 절대 측정이 불가능합니다.
우리는 최근 덴드리머 골격에 감지 염료의 공액에 기초하여 이러한 한계를 극복하기위한 간단하고 효과적인 방법을 설명했다. 5 덴드리머 생물학적 응용을위한 매우 매력적인 특성을 갖는 단 분산 하이퍼 브랜치 폴리머이다. 특히 6가 몇개 수지상 구조가 개발되고 사용되어왔다 약 7 및 유전자 전달을 위해. 8 만 아주 최근에 여러 그룹이 감지 장치를위한 발판으로 이러한 분자의 잠재력을 탐구하기 시작했다. 9,10,11
이전에 우리는NHS-활성화 된 에스테르에 따라 다른 폴리아의 기능화 향해 락 합성 경로 (PAMAM) 발판을 설명했다. 12 접합체만을 정제로서 투석에 의해 단일 단계로 얻어 질 수있다. 흥미롭게도이 방법은 쉽게 수지상 또는 중합체 지지체의 다양한 적용 할 수있다. 13,14
I)의 pH 표시 (예 : 플루오 레세 인) 및 II)의 pH에 의존 형광 부분 (즉, 로다 민) : 비율 적 영상 덴드리머를 달성하기 위해 두 번 표시 염료의 두 세트와 함께했다. 이것은 우리가 형광 및 로다 민 사이의 비율은 pH를에만 의존하고 더 이상의 프로브의 농도에서 정확한 산도 촬상을 수행 할 수 있었다. 수명이 측정이 비율 적 교정이 필요하지 않습니다 프로브 농도에 의존하지 않기 때문에이 문제에 대한 또 다른 흥미로운 접근 방식은 수명 기반 프로브의 사용. (15)에 의해 표현된다. 그러나, 난생etime 측정은 더 복잡 수단 설정이 필요하고 자신의 시간 해상도는 이렇게 자신의 잠재적 인 응용 프로그램을 제한, 빠른 생리 학적 프로세스 차선입니다.
세포 이미징을 수행하기 위해, 프로브는 세포질로 세포막을 가로 질러 전달 될 필요가있다. 덴드리머 때문에 크기와 친수성을 투과 막되어 있지 않으므로, 세포 내 전달은 전기 충격을 통해 달성 될 수있다. 널리 형질에 대한 생물학에서 사용되는이 기술에 의해, 표시 고분자 효율적으로 고품질의 영상을 수행하는 세포로 전달 될 수있다. 고분자 직접 세포질로 전달 될 때 더욱이, 전기 천공으로 덴드리머 내 이입에 관련된 합병증을 피할 수있다. 일렉트로 다른 덴드리머도 특정 표적 서열의 부재에서 세포 내부에 서로 다른 언어 버전을 보여줍니다 흥미롭게 후. 5이 passiv에게전자 만 인해 덴드리머의 물리 화학적 특성에 따라, 대상, 세포 기관 고유의 pH 영상을 달성하기 위해 이용 될 수있다.
비례 이미징은 공 촛점 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 공유 돌기 발판에 접합 플루 오레와 로다 민은 개별적으로 몇 군데 있었다 및 픽셀 단위 비율의지도를 만들었습니다. ionophores에 의해 살아있는 세포에서 세포 내 산도를 제어하는 몇 가지 절차가보고되었다. Ionophores는 세포막을 통해 이온을 수송 할 수 작은 소수성 분자, H + 이온에 대한 ionophores 같은 nigericin로 사용할 수 있습니다 및 덴드리머 기반 센서를 보정하는 데 사용할 수있는 16로 이러한 측정치가 관찰 된 것과 유사 산도에 선형 응답을 공개했다. 체외. 교정 세포 내 pH를 기초로 정확하게 측정 될 수있다. 이러한 측정은 덴드리머 기반 센서는 연구 H + homeost에 귀중한 도구가 될 수 있다는 것을 보여 주었다아시시는 살아있는 세포 병리학 과정에서 pH를 조절 오작동을 포함하는.
우리는 최근 덴드리머 pH 센서는 또한 마취 된 쥐의 뇌에서의 pH 촬상을 행하는, 생체 내에서 적용 할 수 있음을 보여 주었다. 17 인해 생체 센싱 고품질 기술적 도전 생체 조직의 복잡한 환경. 여기에서 우리는 뇌의 정확한 pH를 이미징을 수행하기 위해 해결해야 할 중요한 문제에 중점을두고 생체 내 pH를 영상에 대한 실험 절차에 대한 자세한 설명을 보여줍니다. 이광자 현미경은 두 가지 이유 때문에 사용되어왔다 : ⅰ) 외광의 사용은 표준 공 초점 현미경의 조직 침투의 부족을 극복 할 수 있도록, II) 형광 및 로다 민의 광범위한 이광자 흡수은 동시 자극은 회피 허용 여기 두 파장의 사용과 관련된 합병증. 마우스 뇌의 pH를 측정했다성공적으로 수행, 센서는 쉽게 뇌 세포 외 공간에서의 pH의 변화를 유도 저산소증에 반응한다. 이러한 측정은 덴드리머 계 지표 성공적 동물 모델에서 생체 내에서의 pH의 생리 학적 및 병리학 적 변화를 강조하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
덴드리머 기반 센서와 성공의 pH 이미징을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 I) 올바른 돌기 발판의 선택과 그것을 복합 지표의 수와 세포 또는 생체 내에서 센서 배달 프로토콜의 II) 최적화.
합성 절차는 매우 쉽고, 모든 아민 – 함유 하이퍼 브랜치 폴리머에 거의 적용 할 수있다. 센서는 하나의 단계에서 시판 덴드리머 및 NHS-활성화 된 염료로부터 얻어 질 수?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Isja 데 Feijter와 매트 베이커 유용한 논의에 대해 감사의 말을 전한다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
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