Síntese, Entrega Celular e<em> In vivo</em> Aplicação de sensores de pH à base de Dendrímero

Summary

Sensores de fluorescência são ferramentas poderosas nas ciências da vida. Aqui, descrevemos um método para sintetizar e utilizar os sensores fluorescentes baseados em dendrímero para medir o pH em células vivas e in vivo. O andaime dendríticas aumenta as propriedades de corantes fluorescentes conjugados levando a melhores propriedades de detecção.

Abstract

O desenvolvimento de indicadores fluorescentes representado uma revolução para as ciências da vida. Geneticamente codificados e fluoróforos sintéticos com capacidade de sensoriamento permitiu a visualização de espécies biologicamente relevantes com alta resolução espacial e temporal. Os corantes sintéticos são de particular interesse, graças à sua alta tunability e da ampla gama de analitos mensuráveis. No entanto, estas moléculas sofrem várias limitações relacionadas com a pequena molécula de comportamento (baixa solubilidade, as dificuldades de segmentação, muitas vezes não há imagem raciométrica permitido). Neste trabalho, introduzir o desenvolvimento de sensores baseados em dendrímero e apresentar um processo para a medição do pH in vitro, em células vivas e in vivo. Nós escolhemos dendrímeros como plataforma ideal para os nossos sensores para suas muitas propriedades desejáveis ​​(monodispersity, propriedades ajustáveis, multivalência) que lhes um andaime amplamente utilizado por vários dispositivos biomédicos feitas. A conjugação de pH fluorescenteindicadores para o cadafalso dendrimer levou a um aprimoramento de suas performances de detecção. Em particular dendrímeros exposição reduzido vazamento celular, melhor direcionamento intracelular e permitir medições raciométrica. Estes novos sensores foram utilizados com sucesso para medir o pH em células HeLa vivo e in vivo em cérebro de ratinho.

Introduction

O uso de moléculas fluorescentes para identificar moléculas biologicamente relevantes específicos mudou completamente a nossa forma de estudar sistemas biológicos. Widefield e microscopia confocal permitiu uma visualização em tempo real de alta resolução de processos biológicos e hoje estão entre as técnicas mais populares para estudar eventos biológicos in vitro, em células e in vivo. ¹ Uma melhora significativa foi representado pelo desenvolvimento de indicadores de fluorescência , ou seja, corantes cuja fluorescência é dependente da concentração de uma entidade molecular específico. indicadores de pH e cálcio, em particular, teve um impacto dramático sobre o estudo da fisiologia da célula devido à enorme relevância de ^{2 +} íons H ⁺ em biologia e Ca. ^2,3

Entretanto, a maioria dos corantes sensíveis apresentam várias limitações intrínsecas relacionadas com a sua pequena molécula comportamento, tais como: i) dificuldades em targeti subcelularng; ii) pouca solubilidade em água e, consequentemente, pobre biocompatibilidade;. e iii) o vazamento de células e, assim, falta de capacidade de imagem de lapso de tempo longo ⁴ Por outro lado, o sinal de muitas sondas não pode ser corrigido para a dependência da concentração de corante (não- imagiologia raciométrica) e, por conseguinte, uma medição absoluta nas células ou in vivo, não é possível.

Recentemente, descreveu um método simples e eficaz para ultrapassar estas limitações, com base na conjugação de corantes de detecção sobre um andaime de dendrímero. ^Cinco dendrímeros são polímeros hiper monodispersas com propriedades muito atraentes para aplicações biológicas. ⁶ Em particular, várias arquitecturas dendríticas têm sido desenvolvidos e utilizados para a droga ⁷ e entrega do gene. ⁸ Só muito recentemente vários grupos começaram a explorar o potencial dessas moléculas como suporte para dispositivos de detecção. ^9,10,11

Anteriormentedescrita uma via de síntese simples para a funcionalização de poliamidoamina (PAMAM) diferentes suportes com base em ésteres de NHS-activada. Conjugados ¹² pode ser obtido num único passo, por meio de diálise como a purificação. Curiosamente, este método pode ser facilmente aplicado a uma variedade de suportes poliméricos ou dendríticas. ^13,14

Para alcançar os dendrímeros de imagem raciométrica foram duplamente marcado com dois conjuntos de corantes: i) um indicador de pH (ou seja, a fluoresceína) e ii) uma porção fluorescente independente do pH (ou seja, a rodamina). Isto permitiu-nos realizar imagem pH preciso como o rácio entre a fluoresceína e rodamina é só dependente do pH e não mais sobre a concentração da sonda. Outra abordagem interessante para esta questão é representado pelo uso de sondas à base de toda a vida ^15. À medida que a vida não depende de concentração da sonda essas medidas não precisam de uma correção radiométrica. No entanto, lifmedições Etime requerem uma configuração instrumental mais complicado e sua resolução temporal é sub-ótima para processos fisiológicos rápidos, o que limita as suas aplicações potenciais.

A fim de executar imagiologia intracelular, a sonda tem de ser entregue através da membrana plasmática para o citoplasma. Como os dendrímeros não são membrana permeável devido ao seu tamanho e hidrofilicidade, a entrega intracelular pode ser conseguida por meio de electroporação. Por meio desta técnica, amplamente utilizados em biologia, para a transfecção, as macromoléculas marcadas podem ser eficazmente entregues nas células para realizar imagem de alta qualidade. Além disso, com a electroporação as complicações relacionadas com a dendrímero endocitose pode ser evitado que as macromoléculas são entregues directamente para o citoplasma. Curiosamente após eletroporação diferentes dendrímeros mostra localizações distintas no interior das células, mesmo em ausência de qualquer seqüência de alvos específicos. ⁵ Este passive direccionamento, apenas devido às propriedades físico-químicas do dendrímero, pode ser explorado para atingir o pH de imagem específicos de organelos.

Imagiologia Raciometrico pode ser realizado utilizando microscopia confocal. A fluoresceína e rodamina, covalentemente conjugado com o andaime dendrítica, foram separadamente trabalhada e um pixel-a-pixel proporção mapa foi criado. Vários procedimentos para controlar o pH intracelular em células vivas por meio de ionóforos foram relatados. Os ionóforos são pequenas moléculas hidrófobas capazes de transportar iões através da membrana plasmática; ionóforos de iões H ^+, tais como nigericina, estão disponíveis e podem ser utilizadas para calibrar os sensores baseados em dendrímero ¹⁶ Estas medições revelaram uma resposta linear ao pH de forma semelhante ao que foi descrito. in vitro. Na base do pH intracelular de calibração pode ser medido com precisão. Estas medições demonstraram que o sensor baseado em dendrímero pode ser uma ferramenta valiosa no estudo H ⁺ homeostasis em células vivas e processos patológicos que envolvem falhas de regulação de pH.

Recentemente, demonstrou que os sensores de pH à base de dendrímero também pode ser aplicada, in vivo, a realização de imagens de pH no cérebro de ratos anestesiados. ¹⁷ Devido ao ambiente complexo de tecidos vivos de elevada qualidade na detecção in vivo é tecnicamente exigente. Aqui nós mostramos uma descrição detalhada do procedimento experimental para a imagem in vivo pH com ênfase das questões cruciais a serem abordados para realizar uma imagem pH precisas no cérebro. Microscopia de dois fótons tem sido empregada por duas razões principais: i) o uso de luz infravermelha permite superar a falta de penetração nos tecidos da microscopia confocal padrão; ii) a ampla absorção de dois fótons de fluoresceína e rodamina permitir a sua excitação simultânea evitando a complicações relacionadas com o uso de dois comprimentos de onda para excitação. medições de pH no cérebro de camundongos foramrealizado com sucesso; sensores prontamente responder à hipóxia induzir mudança de pH no espaço extracelular cerebral. Estas medições demonstram que os indicadores baseados dendrímero pode ser utilizado com êxito para destacar as alterações fisiológicas e patológicas do pH in vivo num modelo animal.

Protocol

1. Síntese dos Sensores Na seção seguinte, nós fornecemos um procedimento para a conjugação de indicadores de pH de dendrímeros PAMAM. O mesmo protocolo pode ser aplicado com modificações mínimas para dendrímeros de amina alternativas de rolamento. 5,17,13,14 dendrímeros e corantes comercialmente disponíveis pode ser usada sem mais purificações. Dissolve-se o dendrímero, em DMSO anidro (50 uM de concentração final). Prepare as soluções de 10 mM de fluoresceína-NHS e t…

Representative Results

A Figura 1 mostra uma representação esquemática da conjugação de corantes para detectar diferentes andaimes dendríticas. Os indicadores resultantes podem ser obtidos num passo sintético fácil a partir de produtos disponíveis comercialmente. Os dendrímeros de rolamento-amina reagem com corantes NHS-activada em DMSO e purificada por meio de diálise. Este procedimento geral já foi usado com sucesso para a rotulagem de vários dendrímeros: i) geração dendrímero PAMAM 2, 4 e 6; 12 …

Discussion

Os passos críticos para imagiologia de pH bem sucedido com sensores à base de dendrímero são: i) a selecção do andaime dendrítica correcta e o número de indicadores conjugados com ele e ii) a optimização de um protocolo de entrega do sensor nas células ou in vivo.

O procedimento de síntese é relativamente fácil e pode ser aplicado virtualmente a qualquer polímero hiper-rolamento amina. Os sensores podem ser obtidos a partir de dendrímeros disponíveis comercialmente …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500