Синтез, Сотовый Доставка и<em> В естественных условиях</em> Применение датчиков рН Дендримеров основе
Summary
Датчики флуоресценции являются мощными инструментами в области наук о жизни. Здесь мы опишем методику синтезировать и использовать дендримерных основе датчиков люминесцентные для измерения рН в живых клетках и в естественных условиях. Дендритных леса усиливает свойства сопряженных флуоресцентные красители, ведущих к улучшению свойств зондирования.
Abstract
Развитие люминесцентных индикаторов представляет собой революцию в области наук о жизни. Генетически кодируется и синтетические флуорофоры с возможностями зондирования позволило визуализировать биологически соответствующих видов с высоким пространственным и временным разрешением. Синтетические красители представляют особый интерес благодаря их высокой управляемость и широкий спектр измеряемых веществ. Тем не менее, эти молекулы страдают некоторые ограничения, связанные с поведением малой молекулы (плохая растворимость, трудности в адресности, часто не логометрический изображений не допускается). В этой работе мы вводим развитие датчиков дендримерных основе и представить процедуру измерения рН в пробирке, в живых клетках и в естественных условиях. Мы выбираем дендримеров как идеальную платформу для наших датчиков для их многих желательных свойств (монодисперсности, настраиваемые свойства, многозначности), которые сделали их широко используется эшафот в течение нескольких биомедицинских устройств. Сопряжение люминесцентных рНпоказатели с дендримером эшафот привело к усилению их исполнений зондирования. В частности дендримеров экспонат снижается утечки клеток, улучшение внутриклеточного адресности и позволяют логометрических измерений. Эти новые датчики были успешно использованы для измерения рН в живых HeLa клетки и в естественных условиях в мозге мыши.
Introduction
Использование флуоресцентных молекул маркировать определенные биологически-соответствующие молекулы полностью изменил способ, которым мы учиться биологических систем. Широкоугольный и конфокальной микроскопии позволило в режиме реального времени с высоким разрешением визуализации биологических процессов и в настоящее время являются одними из самых популярных методов для изучения биологических событий в пробирке, в клетках и в естественных условиях. 1 Соответствующий улучшение представляли разработки показателей флуоресценции , т.е. красителей, флуоресценция зависит от концентрации специфического молекулярного лица. рН и кальция показатели, в частности, имел огромное влияние на изучении физиологии клетки из-за огромного актуальности 2 + в биологии Н + и Ca. 2,3
Тем не менее, большинство из красителей зондирования присутствующих несколько внутренние ограничения, связанные с их небольшой поведения молекул, таких как: I) трудности в субклеточной targetiнг; II) плохой растворимостью в воде и, следовательно, плохой биосовместимостью;. и III) утечка клеток и, следовательно, отсутствие долгого изображений возможностью покадровой 4 Кроме того, сигнал из множества зондов не может быть исправлена в зависимости от концентрации красителя (не изображений пропорциональный) и, следовательно, абсолютное измерение в клетках или в естественных условиях невозможно.
Мы недавно описал простой и эффективной методологии преодоления этих ограничений, на основе сопряжения красителей зондирования на дендримеров эшафот. 5 Дендримеры Монодисперсные гиперразветвленные полимеры с очень привлекательных свойств для биологических применений. 6 В частности несколько дендритные архитектуры были разработаны и используются для приготовления 7 и доставки генов. 8 Только в самое последнее несколько групп начали исследовать потенциал этих молекул как эшафот для сенсорных устройств. 9,10,11
Мы ранееописан простой путь синтеза по отношению к функционализации другой полиамидоамина (РАМАМ) строительные леса, основанный на NHS-активированных сложных эфиров. 12 Конъюгаты могут быть получены в одну стадию путем диализа, как только очистки. Интересно этот подход может быть легко применена к различным дендритных или полимерных каркасов. 13,14
Для достижения логометрических дендримеров изображений были дважды меченных с двумя наборами красителей: I) индикаторных рН (т.е. флуоресцеин) и б) рН-независимый флуоресцентный фрагмент (т.е. родамин). Это позволило выполнить точный изображений рН как отношение между флуоресцеин и родамин только зависит от рН и не более от концентрации зонда. Другой интересный подход к этому вопросу представлена использования в течение жизни на основе зондов. 15 Как время жизни не зависит от концентрации зонда эти измерения не нужен логометрические коррекции. Тем не менее, LIFИзмерения Etime требуют более сложный инструментальную установки и их временное разрешение является оптимальным для быстрых физиологических процессов, тем самым ограничивая их возможности применения.
Для того чтобы выполнить внутриклеточного изображений, зонд должен быть доставлен через плазматическую мембрану в цитозоль. Поскольку дендримеры не проницаемой мембраны из-за их размера и гидрофильности, внутриклеточной доставки может быть достигнуто путем электропорации. С помощью этой методики, широко используемые в биологии для трансфекции, меченные макромолекулы могут быть эффективно доставлены в клетки, чтобы выполнить высокое качество изображения. Кроме того, при электропорации осложнений, связанных с дендримера эндоцитоза можно избежать как макромолекулы доставляется в цитоплазме. Интересно после электропорации различных дендримеров показывает различные локализации внутри клеток, даже в отсутствии каких-либо конкретных таргетирования последовательности. 5 этого Passivэ ориентации, только за счет физико-химических свойств дендримере, могут быть использованы для достижения органеллоспецифичными изображений рН.
Логометрический изображений можно выполнить с помощью конфокальной микроскопии. Флуоресцеин и родамин, ковалентно конъюгирован с дендритной строительных лесов, были отображены отдельно и пиксель-на-пиксель соотношение карта была создана. Несколько процедур по контролю внутриклеточного рН в живых клетках с помощью ионофоров не поступало. Ионофоры небольшие гидрофобные молекулы, способные транспортировать ионы через плазматическую мембрану; ионофоры для Н + ионов, таких как нигерицина, доступны и могут быть использованы для калибровки датчиков на основе дендримеров 16 Эти измерения показали линейную реакцию на рН аналогично тому, что наблюдалось. в пробирке. На основе калибровочной внутриклеточного рН может быть точно измерена. Эти измерения показали, что дендример основе датчика может быть ценным инструментом в исследовании Н + homeostASIS в живых клетках и патологических процессов, которые связаны сбои регулирования рН.
Недавно мы показали, что дендример основе датчики рН также может быть применен в естественных условиях, выполняя изображений рН в головном мозге анестезированных мышах. 17 Из-за сложной среде живых тканей высокого качества в естественных зондирования является технически сложной задачей. Здесь мы показываем, подробное описание экспериментальной процедуры в естественных условиях рН изображений с акцентом из важнейших вопросов, которые будут рассматриваться для выполнения точной визуализации рН в мозге. Двухфотонное микроскопии был принят на работу по двум основным причинам: я) использование инфракрасного света позволяет преодолеть отсутствие проникновения в ткани стандартного конфокальной микроскопии; II) широкий двухфотонного поглощения флуоресцеина и родамина позволит избежать их одновременное возбуждение осложнения, связанные с использованием двух длин волн возбуждения. измерения рН в мозге мыши былиуспешно проведены; датчики легко реагировать на гипоксию вызывают изменение рН в мозге внеклеточного пространства. Эти измерения показывают, что дендримеров на основе показателей может быть успешно использован для выделения физиологических и патологических изменение рН в естественных условиях в животной модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги для успешного рН изображений с датчиками дендримеров на основе являются: I) выбор правильного дендритной строительных лесов и количество показателей, конъюгированных с ним и б) оптимизация протокола доставки датчика в клетках или в естественных условиях.
<p class="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Полезные дискуссии с Isja де Feijter и Мэтт Бейкер выражается искренняя признательность.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
References
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
- Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
- Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
- Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
- Caminade, A. -. M., Turrin, C. -. O., Majoral, J. -. P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
- Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
- Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
- Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
- Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
- Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
- Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
- Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
- Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
- Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
- Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
- Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
- Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
- . . Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
