Síntesis, Entrega y Celular<em> En vivo</em> Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

Summary

Sensores de fluorescencia son herramientas poderosas en ciencias de la vida. Aquí se describe una metodología para sintetizar y utilizar sensores fluorescentes basadas en dendrímeros para medir el pH en las células vivas e in vivo. El andamio dendríticas mejora las propiedades de los tintes fluorescentes conjugados que conducen a propiedades mejoradas de detección.

Abstract

El desarrollo de indicadores fluorescentes representó una revolución para las ciencias de la vida. Genéticamente codificados y fluoróforos sintéticas con capacidades de detección permite la visualización de las especies de importancia biológica con alta resolución espacial y temporal. Los colorantes sintéticos son de particular interés, gracias a su elevada capacidad de ajuste y la amplia gama de analitos medibles. Sin embargo, estas moléculas sufren varias limitaciones relacionadas con la pequeña molécula de la conducta (mala solubilidad, las dificultades en la selección, a menudo no hay imagen radiométrica permitido). En este trabajo presentamos el desarrollo de sensores basadas en dendrímeros y presentamos un procedimiento para la medición de pH in vitro, en células vivas y en vivo. Elegimos dendrímeros como plataforma ideal para nuestros sensores por sus muchas propiedades deseables (monodispersidad, propiedades sintonizables, multivalencia) que los de un andamio ampliamente utilizado por varios dispositivos biomédicos hechos. La conjugación del pH fluorescenteindicadores al andamio dendrímero condujeron a una mejora de sus actuaciones de detección. En particular, los dendrímeros presentan reduce las fugas de células, mejorando la orientación intracelular y permitir mediciones radiométricas. Estos nuevos sensores se emplean con éxito para medir el pH en las células HeLa que viven e in vivo en cerebro de ratón.

Introduction

El uso de moléculas fluorescentes para etiquetar moléculas biológicamente relevantes específicos ha cambiado completamente la forma en que estudiamos sistemas biológicos. Widefield y microscopía confocal permitió un tiempo real de alta resolución de visualización de procesos biológicos y en la actualidad se encuentran entre las técnicas más populares para estudiar los eventos biológicos in vitro, en células e in vivo. ¹ Una mejora relevante estuvo representado por el desarrollo de indicadores de fluorescencia , es decir, colorantes cuya fluorescencia es dependiente de la concentración de una entidad molecular específica. indicadores de pH y calcio, en particular, han tenido un impacto dramático en el estudio de la fisiología de las células debido a la enorme relevancia de H ⁺ y Ca ^{2 +} iones en la biología. ^2,3

Sin embargo, la mayoría de los tintes de detección presentan varias limitaciones intrínsecas relacionadas con su comportamiento pequeña molécula, tales como: i) dificultades en targeti subcelularng; ii) escasa solubilidad en agua y por lo tanto pobre biocompatibilidad;. y iii) la fuga de células y por lo tanto la falta de tiempo la capacidad de time-lapse ⁴ Por otra parte, la señal de muchas sondas no se puede corregir para la dependencia de la concentración de colorante (no radiométrica de imágenes) y, por lo tanto, una medida absoluta en células o in vivo no es posible.

Recientemente hemos descrito una metodología sencilla y eficaz para superar estas limitaciones, basado en la conjugación de los tintes de detección en un andamio dendrímero. ⁵ Los dendrímeros son polímeros hiperramificados monodispersas con propiedades muy atractivas para aplicaciones biológicas. ⁶ En particular, varias arquitecturas dendríticas se han desarrollado y utilizado de drogas ⁷ y la entrega de genes. ⁸ Sólo muy recientemente varios grupos comenzaron a explorar el potencial de estas moléculas como andamio para dispositivos de detección. ^9,10,11

Anteriormentese describe una ruta sintética fácil hacia la funcionalización de diferentes poliamidoamina (PAMAM) andamios sobre la base de ésteres activados-NHS. ¹² Los conjugados se pueden obtener en una sola etapa por medio de diálisis como sólo la purificación. Curiosamente este enfoque se puede aplicar fácilmente a una variedad de andamios dendríticas o poliméricos. ^13,14

Para lograr dendrímeros de formación de imágenes radiométricas fueron doble marcado con dos conjuntos de colorantes: i) un indicador de pH (es decir, fluoresceína) y ii) un resto fluorescente independiente del pH (es decir, la rodamina). Esto nos permitió realizar imágenes pH preciso como el cociente entre la fluoresceína y rodamina sólo depende del pH y no más de la concentración de la sonda. Otro enfoque interesante para este problema está representada por el uso de sondas basadas en toda la vida. ¹⁵ Como el tiempo de vida no depende de la concentración de la sonda estas mediciones no necesitan una corrección radiométrica. Sin embargo, LIFmediciones Etime requieren una configuración de instrumento más complicado y su resolución temporal es sub-óptimo para los procesos fisiológicos rápidos, lo que limita sus posibles aplicaciones.

Con el fin de realizar las imágenes de intracelular, la sonda tiene que ser entregado a través de la membrana plasmática en el citosol. Como los dendrímeros no están membrana permeable debido a su tamaño y la hidrofilia, la administración intracelular podría lograrse mediante electroporación. Por medio de esta técnica, ampliamente utilizado en biología para la transfección, macromoléculas marcadas se pueden entregar de manera efectiva en las células para realizar las imágenes de alta calidad. Por otra parte, con la electroporación las complicaciones relacionadas con la endocitosis dendrímero se pueden evitar como las macromoléculas son entregados directamente al citoplasma. Curiosamente después de electroporación diferentes dendrímeros muestran localizaciones distintas dentro de las células, incluso en ausencia de una secuencia de acceso específica. ⁵ Este passive focalización, sólo se debe a las propiedades físico-químicas del dendrímero, se puede aprovechar para lograr imágenes pH-orgánulo específico.

Radiométrico de imágenes se puede realizar utilizando microscopía confocal. Fluoresceína y rodamina, covalentemente conjugado con el andamio dendríticas, se obtuvieron imágenes por separado y una relación de mapa píxel por píxel se ha creado. Se informó de varios procedimientos para controlar el pH intracelular en las células vivas mediante ionóforos. Los ionóforos son pequeñas moléculas hidrófobas capaces de transportar iones a través de la membrana plasmática; ionóforos de iones H ^+, tales como nigericina, están disponibles y se puede utilizar para calibrar sensores basados ​​en dendrímeros ¹⁶ Estas mediciones revelaron una respuesta lineal a pH de manera similar a lo observado. in vitro. Sobre la base de que el pH intracelular de calibración podría ser medido con precisión. Estas mediciones demostraron que el sensor basado en dendrímero puede ser una herramienta valiosa en el estudio de H ⁺ homeostasis en las células vivas y los procesos patológicos que implican un mal funcionamiento de regulación de pH.

Recientemente hemos demostrado que los sensores de pH basados ​​en dendrímeros también se pueden aplicar in vivo, la realización de imágenes de pH en el cerebro de los ratones anestesiados. ¹⁷ Debido a la complejidad del entorno de los tejidos vivos de una alta calidad en la detección in vivo es técnicamente difícil. Aquí se muestra una descripción detallada del procedimiento experimental para obtener imágenes de pH in vivo con énfasis de los temas cruciales que deben abordarse para realizar una imagen precisa del pH en el cerebro. Microscopía de dos fotones ha sido empleado por dos razones principales: i) el uso de la luz infrarroja permite superar la falta de penetración en el tejido de la microscopía confocal estándar; ii) la amplia absorción de dos fotones de fluoresceína y rodamina permite evitar su excitación simultánea del complicaciones relacionadas con el uso de dos longitudes de onda para la excitación. mediciones de pH en el cerebro de ratones fueronllevaron a cabo con éxito; sensores responden fácilmente a la hipoxia induce el cambio de pH en el espacio extracelular del cerebro. Estas mediciones demuestran que los indicadores basados ​​en dendrímeros pueden ser utilizados con éxito para resaltar cambio fisiológico y patológico de pH in vivo en un modelo animal.

Protocol

1. Síntesis de los Sensores En la siguiente sección, se proporciona un procedimiento para la conjugación de indicadores de pH a dendrímeros PAMAM. El mismo protocolo se puede aplicar con modificaciones mínimas a dendrímeros de amina de soporte de alternativas. 5,17,13,14 dendrímeros y colorantes comercialmente disponibles pueden ser utilizados sin más purificaciones. Disolver el dendrímero en DMSO anhidro (concentración final 50 mM). Preparar soluciones madre 10 mM de fluoresce?…

Representative Results

La figura 1 muestra una representación esquemática de la conjugación de detección de colorantes a diferentes andamios dendríticas. Los indicadores resultantes se pueden obtener en una etapa sintética fácil a partir de productos disponibles comercialmente. -Dendrímeros que llevan amina se hacen reaccionar con colorantes activada con NHS en DMSO y se purificaron por diálisis. Este procedimiento general ha sido ya utilizado con éxito para el etiquetado de varios dendrímeros: i) generación del d…

Discussion

Los pasos críticos para formación de imágenes de pH éxito con sensores basados ​​en dendrímeros son: i) la selección del andamio dendríticas correcta y el número de indicadores conjugados a la misma y ii) la optimización de protocolo de entrega sensor en células o in vivo.

El procedimiento de síntesis es bastante fácil y se puede aplicar prácticamente a cada polímero hiperramificado amina-cojinete. Los sensores se pueden obtener de dendrímeros disponibles comercia…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500