Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Résumé

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans un In vivo Contexte. Immunofluorescence de visualiser avec précision le plexus vasculaire est essentielle à la réussite de ce type d'études.

Résumé

L'angiogenèse est le processus complexe de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins défini par la germination de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants. L'angiogenèse joue un rôle essentiel non seulement dans le développement normal des organes et des tissus, mais aussi dans de nombreuses maladies dans lesquelles la formation de vaisseaux sanguins est déréglée, comme le cancer, la cécité et les maladies ischémiques. Dans la vie adulte, les vaisseaux sanguins sont généralement repos si l'angiogenèse est une cible importante pour le développement de médicaments nouveaux pour essayer de réguler la formation de nouveaux vaisseaux spécifiquement dans la maladie. Afin de mieux comprendre l'angiogenèse et d'élaborer des stratégies appropriées pour réglementer cela, les modèles sont nécessaires, qui reflètent avec précision les différentes étapes biologiques qui sont impliqués. La rétine de la souris néonatale constitue un excellent modèle de l'angiogenèse, car les artères, les veines et les capillaires se développent pour former un plexus vasculaire au cours de la première semaine après la naissance. Ce modèle a également l'avantage d'avoir un deux-didimensionnelle (2D) la structure qui rend l'analyse directe par rapport à l'anatomie 3D complexe d'autres réseaux vasculaires. En analysant le plexus vasculaire rétinienne à différents moments après la naissance, il est possible d'observer les différentes étapes de l'angiogenèse sous le microscope. Cet article montre une procédure simple pour analyser la vascularisation de la rétine de la souris en utilisant une coloration fluorescente avec des anticorps spécifiques isolectine et vasculaire.

Introduction

L'angiogenèse est un processus complexe du développement définie par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants et est réglementé par plusieurs voies de signalisation. Le plus important d'entre eux est la voie du VEGF. VEGF est libéré par les cellules ischémiques et conduit à l'initiation de la germination angiogénique dans les vaisseaux sanguins avoisinants. Les cellules endothéliales de premier plan à partir d'une nouvelle pousse vasculaire est une cellule «pointe», qui produit filopodes qui atteignent en direction de la source de VEGF, et est suivie par des cellules endothéliales proliférantes "ti....

Protocole

Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Énucléation et la fixation des Yeux postnatale

1. Placez la souris euthanasiés chiot de son côté, enlever la peau qui recouvre l'œil avec des ciseaux.
2. Utilisez des ciseaux et des pinces pour énucléer l'œil.
3. Placez les ciseaux sous l'œil énucléé, couper le nerf optique et des tissus environnants et soulever l'œil. Transfert à une plaque de 24 puits contenant du paraformaldéhyde 4% (PFA) constitué en 2x PBS à température ambiante.
4. Permettre à chaque œil pour fixer pendant 10 - 15 min, puis transfert à ....

Résultats

Après dissection de la rétine devrait ressembler à une fleur plat (Figure 1). En utilisant le protocole décrit ci-dessus, les cellules endothéliales peuvent être vus à l'aide isolectine coloration B4-Alexa488 et en soutenant les cellules musculaires vasculaires sont visualisés à l'aide anti-alpha actine musculaire lisse (Figure 2). Le point de vue de faible puissance utilisant un objectif 5X dans la figure 2 permet une vue d'ensemble de l'organisation va.......

Discussion

La méthode présentée ici offre un moyen simple et efficace pour obtenir des images de préparations colorées de montage entières de rétines de souris néonatales, ce qui en fait un modèle facilement quantifiable et physiologiquement pertinents de l'angiogenèse. Initialement, l'œil de la souris peut être assez difficile à disséquer en raison de sa petite taille et la forme du globe, alors un peu de pratique et de bons outils de dissection sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dissection des yeux prép.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
Pipettes en plastique 3 ml	Fournitures de laboratoire scientifique	PIP4210	Retirez l’embout avec des ciseaux pour créer un large alésage
Plaques BD Falcon 24 puits	Fournitures de laboratoire scientifique	353226
Boîtes de Pétri Select TV 90 mm	Fournitures de laboratoire scientifique	SLS2002
lames Histobond	VWR	631-0624
Lamelles 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Pince à épiler #5	World precision instruments	14095
Ciseaux à ressort de 10,5 cm de long, avec lames droites de 8 mm	Instruments de précision World	501235	Utilisé pour l’énucléation
Ciseaux Vannas de 8,5 cm de long, avec lames droites de 7 mm et pointes superfines de 0,025 x 0,015 mm	World precision instruments	500086	Utilisé pour la dissection de la rétine
Ciseaux vannes superfins de 8 cm de long avec lames droites de 3 mm et pointes superfines de 0,015 x 0,015 mm	Instruments de précision World	501778	Utilisé pour la dissection de la rétine
tubes limpide’ ; 2 ml	Starlab	E1420-2000
réactifs
Phosphate de sodium dibasic	Sigma	S0876	Réactif PBS
Phosphate de potassium monobasique	Sigma	P5655	Réactif PBS
Chlorure de sodium	Sigma	S9625	Réactif PBS
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148	Compléter en 2x PBS et stocker à -20 ° ; C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Sérum d’âne	Sigma	D9663
Sérum de chèvre	Vecteur	S-1000
Réactif anti-décoloration Prolong Gold	Invitrogen	P36930	Réactif de montage
Isolectine GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Utilisation à Dilution 1:200
Isolectine GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Utilisation à dilution 1:200
Anticorps primairesAnti-NG2 (lapin polyclonal)Millipore AB5320 Détecte les péricytes Anti-GFAP (clone GA5, souris monoclonale)Millipore MAB360 Détecte les astrocytes Anti-Desmin (clone Y66,
monoclonal de lapin)	Millipore	04-585	Détecte les péricytes
Anti-Collagène IV (polyclonal de lapin	Chemicon	AB756P	Détecte la membrane basale vasculaire
Anti-alpha muscle lisse actine-Cy3 (clone 1A4, souris monoclonale)	Sigma	C6198	Détecte les cellules musculaires lisses vasculaires.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Détecte les cellules endothéliales
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Détecte les cellules endothéliales
Anti-VE-Cadhérine (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Détecte les jonctions cellulaires endothéliales
Anti-Alk1 (chèvre polyclonale)	R& D Systems	AF770	Détecte les cellules
Anticorps secondaires
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Chèvre anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	Tous les anticorps secondaires sont aliquote immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Chèvre anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Chèvre anti-souris-Alexa488	Invitrogen	A11029	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Âne anti-chèvre-Alexa594	Invitrogen	A11058	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Microscopes
Microscope de dissection	Caméra Zeiss	Stemi SV6
Caméra	Zeiss	Axiocam HRc	pour microscope de dissection
Microscope épifluorescent	Zeiss	Axioimager avec caméra Apotome
Caméra	Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager
	Nikon	A1R

) endothéliales pour microscope confocal