Hele Mount Immunofluorescent Farging av Neonatal Mouse Retina å etterforske Angiogenesis<em> In vivo</em

Summary

Nyfødtperioden murine netthinnen gir et godt karakterisert fysiologiske modell av angiogenese, som tillater undersøkelser av rollene til ulike gener eller medikamenter som modulerer angiogenese i en<em> In vivo</em> Sammenheng. Immunofluorescent flekker å nøyaktig visualisere vaskulær plexus er avgjørende for å lykkes med disse typer studier.

Abstract

Angiogenese er den komplekse prosessen med dannelsen av nye blodkar definert av spirende av nye blodkar fra en pre-eksisterende fartøy nettverk. Angiogenese spiller en viktig rolle, ikke bare i normal utvikling av organer og vev, men også i mange sykdommer hvor blodkar formasjonen er feilregulert, så som kreft, blindhet og ischemiske sykdommer. I voksen alder, blodårer er generelt sovende så angiogenese er et viktig mål for romanen narkotika utvikling å prøve og regulere nye fartøy dannelse spesielt i sykdom. For bedre å forstå angiogenese og å utvikle hensiktsmessige strategier for å regulere det, er modeller som kreves som nøyaktig gjenspeiler de ulike biologiske trinn som er involvert. Musen neonatal netthinnen gir en utmerket modell av angiogenese fordi arterier, vener og kapillærer utvikle seg til å danne en vaskulær plexus løpet av den første uken etter fødselen. Denne modellen har også fordelen av å ha en to-dimensional (2D) struktur gjør analyse grei sammenlignet med komplekse 3D anatomi av andre vaskulære nettverk. Ved å analysere retinal vaskulær plexus til forskjellige tider etter fødselen, er det mulig å observere de ulike stadier av angiogenese under mikroskopet. Denne artikkelen viser en enkel prosedyre for å analysere blodkar av en mus netthinnen ved hjelp av fluorescerende farging med isolectin og vaskulær spesifikke antistoffer.

Introduction

Angiogenese er en kompleks utviklingsprosess definert av dannelsen av nye blodkar fra en pre-eksisterende fartøy nettverk og er regulert av flere signalveier. Den mest fremtredende av disse er VEGF veien. VEGF er utgitt av iskemisk celler og fører til igangsetting av angiogeniske spire i nabolandet blodkar. Den ledende endotelceller fra en ny vaskulær spire er en "spiss" cellen, som produserer filopodia som strekker seg ut mot kilden av VEGF, og etterfølges av prolifererende 'stilken "endotelceller. På denne måten aktiverte endotelceller migrerer og sprer mot en avaskulære region hvor de danner nye vaskulære rør. For å stabilisere disse rørene for å støtte blodstrøm, endotelialceller samhandler med pericytes og glatte muskelceller, som omgir de nye blodkar ^1. Angiogenese er viktig for vascularization av embryoet og voksende vev. Men det bidrar også til mange patologiskgiske sykdommer slik som cancer, mens defekter i angiogenese er assosiert med ischemiske sykdommer. Utviklingen av effektive stoff behandlinger for å regulere angiogenese som et middel for behandling av sykdom er derfor av stor interesse. For eksempel vil effektive anti-angiogene faktorer redusere kreftutvikling, mens pro-angiogene strategier kan anvendes for å behandle iskemisk sykdom. Dermed modeller av angiogenese er avgjørende for å bedre forstå reguleringen av nye fartøy dannelse og for å utvikle nye terapeutiske strategier for å forbedre eller redusere vaskulær vekst.

Et grunnleggende element av angiogenese forskning er valget av en passende vaskulær modell. Mange in vitro-modeller har blitt laget for å gjengi de grunnleggende trinnene av angiogenese som endotelcellemigrasjon, spredning og overlevelse ^2,3. En mye benyttet in vitro-analysen er dannelsen av et forgrenet nettverk av endoteliale celler i et Matrigel matrise, selv om thans er ikke spesifikk for endotelceller, og heller ikke gjør det vanligvis innlemme støtte av pericytes eller glatte muskelceller. Vurdering av ex vivo spirende angiogenese ved hjelp mus organ kultur slik som embryoid legeme analyse ble aorta-ring analysen og fosterets metatarsal analysen tillater analyse av angiogenese av endotelceller i sammenheng med ytterligere støtte celler. Imidlertid, de viktigste begrensninger av disse analysene er mangelen på blodstrøm og regresjon av fartøy over tid, noe som gir en begrenset vindu for analyse. Derfor, for å forstå regulering av angiogenese mer nøyaktig, er in vivo-modeller som kreves slik som de som er utviklet i mus ved hjelp av subkutant implanterte svamper eller Matrigel plugger, så vel som den hind iskemi i bena modell. Imidlertid er disse modellene utfordrende å analysere på grunn av den komplekse 3D-arkitekturen i neovessels. I kontrast, har sebrafisk embryo viste en utmerket modell for å visualisere angiogenese i heleorganisme ^fire. Imidlertid er evolusjonært mus mye mer nært beslektet med humant enn zebrafisk, noe som gjør mus en foretrukket modell i mange tilfeller. Følgelig angiogenese av postnatal mus netthinnen representerer et godt karakterisert metoden for valg for angiogenese forskning. Det gir ikke bare en fysiologisk innstilling, men også en 2D vaskulær plexus som lett kan visualiseres ved hjelp av egnede fluorescerende flekker. Arkitekturen av fartøyet nettverk, endotelial spredning, spirende, perivaskulær celle rekruttering og fartøy ombygging kan alle bli undersøkt ved hjelp av denne teknikken.

I neonatal mus netthinnen, skjer utviklingen av netthinnens blodkar i den første uken av postnatal liv. Mus, i motsetning til mennesker, er født blind og netthinne bare bli vaskularisert etter fødselen. Retinale blodkar oppstå fra midten av netthinnen nær den optiske nerven ved postnatal dag 0 (P0), og utvikle ved angiogenese for å danne en svært organisered vaskulær plexus som når netthinnens periferi med ca P8 ^fem. Blodkar utvikle seg på en karakteristisk måte med den kapillære plexus gradvis vokser utover fra den optiske platen mot periferien for å generere en regelmessig vekslende mønster av arterier og vener med en mellomliggende kapillært nettverk. Netthinnens blodkar gir en ideell modell for å studere angiogenese som skipene kan lett identifiseres som de vokser i hva er egentlig et 2D-plan, og dermed gjør det relativt enkelt å undersøke retinal blodkar i flat-mount forberedelser ^fem. En fremgangsmåte for isolering av den neonatale mus netthinnen for analyse av endoteliske tip celle responser over flere timer ex vivo er blitt rapportert ^6.. Alternativt krever en mer detaljert undersøkelse av hele retinal blodkar og tilhørende vaskulære markører farging av faste netthinnen prøver på ulike stadier av utviklingen.

Her gir vien detaljert beskrivelse av en pålitelig og teknisk rett frem metode som vi bruker for hele fjellet farging av murine retinal vaskulær plexus, fra den første enucleation av postnatal øyet (se også ⁷⁾ gjennom fargingsprotokoller til endelig bildebehandling under mikroskopet.

Protocol

Alle trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. En. Enucleation og fiksering Postnatal Eyes Plasser avlives mus valp på sin side, fjerne huden som dekker øyet med saks. Bruk saks og pinsett for å enucleate øyet. Plasser saks under enucleated øye, kutt synsnerven og omkringliggende vev og løft ut øyet. Overføring til en 24-brønns plate som inneholder 4% paraformaldehyd (PFA) blandet med 2 x PBS ved romtemperatur. Tilla…

Representative Results

Etter disseksjon netthinnen skal se ut som en flat blomst (figur 1). Ved hjelp av protokollen, som er skissert ovenfor, kan endotelceller ses ved hjelp isolectin B4-Alexa488 farging og støtte karmuskelcelier blir visualisert ved hjelp av anti-alfa glattmuskel-aktin (figur 2). Den lave kraft visning ved hjelp av et objektiv 5X i figur 2 gir en oversikt over den vaskulær organisering av netthinnen. Også, ved hjelp av en annen kombinasjon av antistoffer som er gitt i pr…

Discussion

Metoden som presenteres her tilbyr en enkel og effektiv måte å få bilder av farget hele montere preparater av neonatal mus netthinne, noe som gjør det til et lett kvantifiserbare og fysiologisk relevant modell av angiogenese. I utgangspunktet kan du bruke musen øye være ganske vanskelig å dissekere på grunn av sin lille størrelse og kloden form, så litt trening og gode disseksjon verktøy er nødvendig for pålitelige resultater. Disseksjon av øynene fremstilt i 2x konsentrasjon av PBS er viktig fordi dette m…

Materials

			Material
Plastic pipettes 3 ml	Scientific Laboratory Supplies	PIP4210	Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates	Scientific Laboratory Supplies	353226
Select Petri dishes TV 90 mm	Scientific Laboratory Supplies	SLS2002
Histobond slides	VWR	631-0624
Coverslips 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Tweezers #5	World precision instruments	14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades	World precision instruments	501235	Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	500086	Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	501778	Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml	Starlab	E1420-2000
			Reagents
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876	PBS reagent
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	PBS reagent
Sodium chloride	Sigma	S9625	PBS reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Donkey serum	Sigma	D9663
Goat serum	Vector	S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36930	Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Use at 1:200 dilution
			Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal )	Millipore	AB5320	Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)	Millipore	MAB360	Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)	Millipore	04-585	Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )	Chemicon	AB756P	Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)	Sigma	C6198	Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal)	R&D Systems	AF770	Detects endothelial cells
			Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488	Invitrogen	A11029	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594	Invitrogen	A11058	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
			Microscopes
Dissection microscope	Zeiss	Stemi SV6
Camera	Zeiss	Axiocam HRc	Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope	Zeiss	Axioimager with Apotome
Camera	Zeiss	Axiocam HRm	Camera for Axioimager
Confocal Microscope	Nikon	A1R