La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer
Summary
L'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 dans les cellules cancéreuses en mitose a été documentée en temps réel par imagerie confocale en direct. 34-PJ cancer du sein humain éradiqué MDA-MB-231 cellules hébergeant des extra-centrosomes dans la mitose. Contrairement à la mitose bifocal normale, les extra-centrosomes sont regroupés dans les deux pôles du fuseau, en présence d'PJ-34.
Abstract
Dérivés de phénanthrène agissant comme inhibiteurs puissants PARP1 empêché le regroupement bi-focal de centrosomes surnuméraires dans les cellules cancéreuses humaines multi-centrosomales en mitose. Le phénanthridiniques PJ-34 est la molécule la plus puissante. Declustering d'extra-centrosomes provoque l'échec de la mitose et la mort cellulaire dans les cellules multi-centrosomales. Cancers humains les plus solides ont une forte présence des extra-centrosomes. L'activité de PJ-34 a été documentée en temps réel par imagerie confocale de cancer du sein humain vivant des cellules MDA-MB-231 transfectées avec des vecteurs codant pour fluorescent γ-tubuline, ce qui est très abondant dans les centrosomes et fluorescent histone H2B présent dans les chromosomes. Arrangements de chromosomes aberrants et de cluster-foyers γ-tubuline représentant centrosomes declustered ont été détectés dans les cellules transfectées MDA-MB-231 après le traitement avec PJ-34. Un-cluster-centrosomes supplémentaire dans les deux pôles du fuseau précédé leur mort cellulaire. Ces résultats liés for la première fois l'activité cytotoxique exclusive récemment détecté de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines avec des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose, et l'échec de la mitose conduisant à la mort cellulaire. Selon les résultats précédents observés par imagerie confocale de cellules fixes, PJ-34 cellules cancéreuses exclusivement éradiqué avec Multi-centrosomes sans altérer les cellules normales en mitose avec deux centrosomes et les broches bi-focal. Cette activité cytotoxique de PJ-34 n'a pas été partagée par d'autres PARP1 inhibiteurs puissants, et a été observée dans PARP1 déficientes MEF extracentrosomes hébergeant, suggérant son indépendance de PARP1 inhibition. Vivez l'imagerie confocale offre un outil utile pour identifier de nouvelles molécules éradiquer les cellules en mitose.
Introduction
Phénanthrène dérivé PARP1 inhibiteurs, y compris PJ-34, ont été conçus pour protéger les cellules au repos de la mort cellulaire par apoptose induite par le consommateur d'énergie PARP1 médiation réparation de l'ADN dans des conditions de stress (accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) 1. Toutefois, récemment, nous avons découvert que PJ-34, à une concentration deux fois plus élevée que celle induisant PARP1 inhibition, peut exclusivement provoquer la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses humaines 2,3. Le plus rapide de la prolifération de la cellule était, le plus efficace à l'éradication des cellules était. L'activité cytotoxique de PJ-34 a été attribuée à des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose 2. Beaucoup humain cellules cancéreuses port multicentrosomes 4,5. L'incubation des cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231, qui abritent centrosomes surnuméraires, avec 20 uM PJ-34 éradiquée efficacement ces cellules au sein de 72-96 heures sans altérer les cellules au repos ou certaines cellules proliférantes bénignes abriter deux centrosomes dans la mitose <sup> 2,3. Cellules bénignes inclus cellules épithéliales mammaires humaines MCF-10, les cellules endothéliales humaines (HUVEC) et des cellules mésenchymateuses primaires préparées à partir de thymus humain. Ces cellules étaient résistantes à l'activité cytotoxique de PJ-34. PJ-34 n'interfère pas avec leur cycle cellulaire pendant 96 heures d'incubation ou d'affecter leur centrosomes et la formation du fuseau bi-focale 2,3.
Assemblée centrosome bipolaire est cruciale pour la formation du fuseau bipolaire dans la mitose 4,5. Par conséquent, les cellules avec plus de deux centrosomes ont mis au point un mécanisme moléculaire à peine compris, le regroupement de leurs centrosomes supplémentaires à deux pôles 4-9. Le défaut de montage bipolaire de leurs centrosomes peut causer multipolaire déformée broches et aberrant chromosomes ségrégation qui arrête le cycle cellulaire en G2 / M arrestation et conduit à la mort cellulaire attribuées à l'échec de la mitose 4,5. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à des extra-centrosomes de-clusters sont intensivement étudiées <sup> 10. La compréhension de ce mécanisme de mort permettra l'éradication exclusive des cellules cancéreuses tout en épargnant les tissus sains 5,10.
Ainsi, les composés qui activent la mort des cellules catastrophe mitotique offrent un nouveau mode de traitement du cancer sélectif, qui peut être efficace dans un large éventail de résultats de cancers.Our solides humaines suggèrent que l'imagerie confocale peut être utilisé pour identifier les molécules qui affectent extra-centrosomes regroupement en mitose 2,3, ce qui rend ces composés ciblant le cancer des candidats-médicaments.
Nous avons documenté l'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 par les cellules cancéreuses humaines fixe et direct (avec une forte présence d'extra-centrosomes dans la mitose) par rapport aux cellules normales de numérisation. Une étape par étape description des procédures d'imagerie utilisées pour identifier l'activité cytotoxique de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines est inclus ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vivez l'imagerie confocale a fourni une documentation en temps réel de l'effet cytotoxique de PJ-34 dans les cellules multi-centrosomales en direct pendant la mitose (Figure 3 et les informations supplémentaires). Ce fut la première documentation en direct attribuant la cytotoxicité de PJ-34 dans les cellules humaines de cancer de centrosomes supplémentaires de-regroupement et la mort cellulaire, suggérant l'induction de la mort cellulaire de la catastrophe mitotique par PJ-34 5-9…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les sources de financement de cette recherche: un fonds commun de la société de l'Université de Tel Aviv de transfert technologique, Ramot et le Centre Sheba-Medical (M. CA et SI)., ICRF – Fondation de la recherche sur le cancer israélien (M. CA.) Et la Fondation israélienne des sciences ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
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