Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro
Summary
L'attività citotossica della fenantridina PJ-34 in cellule tumorali in mitosi è stata documentata in tempo reale dai confocale vivo. PJ-34 sradicato cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule che ospitano in più-centrosomi nella mitosi. A differenza della normale mitosi bi-focale, l'extra-centrosomi non sono stati raggruppati in due poli del fuso in presenza di PJ-34.
Abstract
Derivati Fenantrene che agiscono come potenti inibitori PARP1 impedito il raggruppamento bi-focale di centrosomi soprannumerari nelle celle multi-centrosomica tumorali umane in mitosi. Il fenantridina PJ-34 è stata la più potente molecola. Declustering di extra-centrosomi provoca insufficienza mitotico e la morte cellulare nelle cellule multi-centrosomica. Tumori umani più solidi hanno alta presenza di extra-centrosomi. L'attività di PJ-34 è stata documentata in tempo reale da imaging confocale di cancro al seno umano vivo MDA-MB-231 cellule trasfettate con vettori codificanti per fluorescente γ-tubulina, che è altamente abbondante nei cntrosome e per fluorescente istone H2b presente in i cromosomi. Cromosomi aberranti arrangiamenti e de cluster-foci γ-tubulina che rappresentano centrosomi declustered sono stati rilevati nelle transfettate cellule MDA-MB-231 dopo il trattamento con PJ-34. Un-cluster in più-centrosomi nei due poli del fuso preceduto la loro morte cellulare. Questi risultati legati for la prima volta l'attività citotossica esclusivo recentemente rilevata del PJ-34 in cellule tumorali umane con supplemento cntrosome-de-clustering in mitosi e insufficienza mitotico che porta alla morte cellulare. Secondo i risultati precedenti osservati con l'imaging confocale di cellule fisse, PJ-34 cellule tumorali debellata esclusivamente con il multi-centrosomi senza danneggiare le cellule normali subiscono mitosi con due centrosomi e mandrini bi-focale. Questa attività citotossica di PJ-34 non è stata condivisa da altri potenti inibitori PARP1, ed è stata osservata in PARP1 deficienti MEF extracentrosomes ospitano, suggerendo la sua indipendenza di PARP1 inibizione. Vivere confocale offerto uno strumento utile per l'individuazione di nuove molecole sradicare le cellule durante la mitosi.
Introduction
Fenantrene deriva inibitori PARP1, tra cui PJ-34, sono stati progettati per proteggere le cellule quiescenti di morte cellulare per apoptosi indotta dal consumo di energia PARP1 mediata riparazione del DNA in condizioni di stress (ictus o infarto del miocardio) 1. Tuttavia, di recente abbiamo scoperto che PJ-34, a concentrazione due volte più alta di quella che induce PARP1 inibizione, può causare la morte delle cellule esclusivamente in cellule tumorali umane 2,3. Più rapida è la proliferazione della cellula era, più efficiente l'eradicazione delle cellule era. L'attività citotossica di PJ-34 è stato attribuito a extra-centrosomi de-clustering in mitosi 2. Molte cellule tumorali porto umano multicentrosomes 4,5. Incubazione di cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231, che ospitano centrosomi soprannumero, con 20 micron PJ-34 efficientemente debellate queste cellule entro 72-96 ore senza danneggiare le cellule quiescenti o alcuni proliferativi benigni ospitare due centrosomi in mitosi <sup> 2,3. Cellule benigne incluse cellule epiteliali mammarie umane MCF-10, cellule endoteliali umane (HUVEC) e cellule mesenchimali primari preparati da timo umano. Queste cellule erano resistenti alla attività citotossica di PJ-34. PJ-34 non ha interferito con il loro ciclo cellulare durante le 96 ore di incubazione o influenzare i loro centrosomi e formazione del fuso bi-focale 2,3.
Bipolare assemblea centrosoma è cruciale per la formazione del fuso bipolare in mitosi 4,5. Pertanto, le cellule con più di due centrosomi hanno sviluppato un meccanismo molecolare poco capito, raggruppando i loro centrosomi ai due poli 4-9. Fallimento di montaggio bipolare dei loro centrosomi può causare multipolare distorto mandrini e aberrante cromosomi segregazione che arresta il ciclo cellulare in G2 / M arresto, e porta alla morte cellulare attribuite al fallimento mitotico 4,5. I meccanismi molecolari alla base di olio extra-centrosomi de-cluster sono intensamente studiate <sup> 10. La comprensione di questo meccanismo di morte consentirà eradicazione esclusivo delle cellule tumorali risparmiando i tessuti sani 5,10.
Così, composti che attivano la morte cellulare mitotico catastrofe offrono una nuova modalità di una terapia del cancro selettivo, che può essere efficace in una vasta gamma di risultati cancers.Our solidi umani suggeriscono che l'imaging confocale può essere utilizzato per identificare molecole che influenzano extra-cntrosome clustering in mitosi 2,3, rendendo questi composti cancro mira candidati farmaci.
Abbiamo documentato l'attività citotossica del fenantridina PJ-34 tramite la scansione cellule tumorali umane fisse e vivo (con alta presenza di extra-centrosomi in mitosi) contro le cellule normali. Un passo-passo le procedure di imaging utilizzate per identificare l'attività citotossica di PJ-34 in cellule tumorali umane di seguito è incluso.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diretta confocale ha fornito una documentazione in tempo reale l'effetto citotossico di PJ-34 in cellule multi-centrosomica dal vivo durante la mitosi (figura 3 e le informazioni supplementari). Questa è stata la prima documentazione vivo attribuendo la citotossicità di PJ-34 in cellule tumorali umane di centrosomi de-clustering e di morte cellulare, suggerendo l'induzione di morte cellulare mitotica Catastrophe da PJ-34 5-9. Al contrario, il clustering bi-focale di centrosomi su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le fonti di finanziamento di questa ricerca: un fondo comune di società dell'Università di Tel Aviv, il trasferimento tecnologico, RAMOT e-Sheba Medical Center (M. CA e SI.), ICRF – israeliana Cancer Research Foundation (M. CA.) E Israel Science Foundation ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
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