Celledød Associated med Unormal Mitosis Observert av Confocal Imaging in Live-kreftceller
Summary
Den cytotoksiske aktiviteten til phenanthridine PJ-34 i kreftceller som gjennomgår mitose ble dokumentert i sanntid ved konfokal levende avbildning. PJ-34 utryddet menneskelig brystkreft MDA-MB-231 celler som ekstra-centrosomes i mitose. I motsetning til normal bi-fokale mitose, ble de ekstra-centrosomes ikke gruppert i de to spindel polene i nærvær av PJ-34.
Abstract
Fenantren derivater som fungerer som potente PARP1 hemmere hindret bi-fokale clustering av overtallige centrosomes i multi-centrosomal humane kreftceller i mitose. Den phenanthridine PJ-34 var den mest potente molekylet. Declustering av ekstra-centrosomes fører mitotisk svikt og celledød i multi-centrosomal celler. Mest solide kreft hos mennesker har høy forekomst av ekstra-centrosomes. Aktiviteten av PJ-34 ble dokumentert i sanntid ved confocal avbildning av levende menneske brystkreft MDA-MB-231 celler transfektert med vektorer som koder for fluorescerende γ-tubulin, som er svært rik på de centrosomes og for fluorescerende histone H2b stede i kromosomene. Avvikende kromosomer ordninger og de-klynger γ-tubulin brennpunkter representerer declustered centrosomes ble oppdaget i transfekterte MDA-MB-231 celler etter behandling med PJ-34. Un-gruppert ekstra-centrosomes i de to spindel polene innledet sin celledød. Disse resultatene knyttet for første gang nylig oppdaget eksklusive cytotoksisk aktivitet av PJ-34 i humane kreftceller med ekstra-centrosomes de-clustering i mitose, og mitotic svikt fører til celledød. Ifølge tidligere funn observert ved confocal avbildning av faste celler, PJ-34 utelukkende utryddet kreftceller med multi-centrosomes uten å svekke normale celler gjennomgår mitose med to centrosomes og bi-fokale spindler. Dette cytotoksisk aktivitet av PJ-34 ble ikke delt av andre potente PARP1 hemmere, og ble observert i PARP1 mangelfulle MEF skjuler extracentrosomes, noe som tyder sin uavhengighet av PARP1 hemming. Leve confocal bildebehandling tilbudt et nyttig verktøy for å identifisere nye molekyler utrydde celler under mitose.
Introduction
Fenantren avledet PARP1 hemmere, inkludert PJ-34 ble utviklet for å beskytte hvilende celler fra celledød ved apoptose indusert av energikrevende PARP1 mediert DNA-reparasjon under stress forhold (slag eller hjerteinfarkt) 1. Men nylig oppdaget vi at PJ-34, på to ganger høyere konsentrasjon enn det inducing PARP1 hemming, kan utelukkende føre til celledød i humane kreftceller 2,3. Jo mer hurtig spredning av cellen var, jo mer effektiv utryddelse av cellene. Cellegiften aktiviteten til PJ-34 ble tilskrevet ekstra-centrosomes de-clustering i mitose to. Mange menneskelig kreft celler havn multicentrosomes 4,5. Inkubasjon av menneskelig brystkreft celler MDA-MB-231, som havna overtallige centrosomes, med 20 mikrometer PJ-34 effektivt utryddet disse cellene innen 72-96 timer uten å svekke hvilende celler eller noen godartede prolifererende celler som to centrosomes i mitose <sup> 2,3. Godartede celler inkludert menneskelige mammary epitelceller MCF-10, Human endotelceller (HUVEC) og primære mesenchymalceller forberedt fra menneskelige thymus. Disse cellene var resistente overfor den cytotoksiske aktivitet av PJ-34. PJ-34 ikke forstyrre med sin celle syklus i løpet av 96 timer inkubasjon eller påvirke deres centrosomes og bi-fokale spindel formasjon 2,3.
Bipolar sentrosomen montering er avgjørende for bipolar spindel formasjonen i mitose 4,5. Derfor har celler med mer enn to centrosomes utviklet et knapt forstått molekylære mekanismen, clustering sine ekstra centrosomes på to poler 4-9. Unnlatelse av bipolar montering av sine centrosomes kan forårsake multipolar forvrengt spindler og avvikende kromosomer segregering at arrestasjoner celle-syklus i G2 / M arrest, og fører til celledød tilskrives mitotic svikt 4,5. De molekylære mekanismene bak ekstra-centrosomes de-clustering er intensivt undersøkt <sup> 10. Forstå dette dødsfallet mekanismen vil gjøre eksklusive utrydding av kreftceller mens sparsom sunt vev 5,10.
Således kan forbindelser som aktiverer mitotisk katastrofe celledød tilbyr en ny måte av en selektiv cancer terapi, som kan være effektive i et bredt spekter av humane solide cancers.Our resultater tyder på at konfokal avbildning kan anvendes for å identifisere molekyler som påvirker ekstra-centrosomes clustering i 2,3 mitose, rendering disse forbindelser kreft målretting narkotika kandidater.
Vi har dokumentert den cytotoksiske aktiviteten til phenanthridine PJ-34 ved å skanne faste og levende humane kreftceller (med høy forekomst av ekstra-centrosomes i mitose) versus normale celler. En trinnvis beskrivelse av imaging prosedyrer som brukes til å identifisere den cytotoksiske aktiviteten til PJ-34 i humane kreftceller er inkludert nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leve confocal bildebehandling gitt en real-time dokumentasjon av den cytotoksiske effekten av PJ-34 i levende multi-centrosomal celler under mitose (figur 3 og utfyllende informasjon). Dette var den første live dokumentasjon tilskrive cytotoksisitet av PJ-34 i humane kreftceller til ekstra centrosomes de-clustering og celledød, noe som tyder induksjon av Mitotisk Catastrophe celledød ved PJ-34 5-9. I kontrast, ble bi-fokale clustering av super-numerario centrosomes observert i levende ubeh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering kilder til denne forskningen: et felles fond av Tel Aviv University teknologioverføring selskapet, Ramot og Sheba-Medical Center (M. CA og SI.), ICRF – Israelsk Cancer Research Foundation (M. CA.) Og Israel Science Foundation ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5′-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let’s huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
