Vi beskriver utarbeidelse av tre testprøvene og hvordan de kan brukes til å optimalisere og vurdere ytelsen til STORM mikroskoper. Ved hjelp av disse eksemplene viser vi hvordan du kan skaffe rådata og deretter behandle det å skaffe seg super-oppløsning i celler på ca 30-50 nm oppløsning.
STORM er en nylig utviklet super-oppløsning mikroskopi teknikk med opptil 10 ganger bedre oppløsning enn standard fluorescens mikroskopi teknikker. Men, som bildet er ervervet i en helt annen måte enn vanlig, ved å bygge opp et bilde molekyl-by-molekyl, er det noen betydelige utfordringer for brukerne i å prøve å optimalisere sitt image oppkjøpet. For å hjelpe denne prosessen og få mer innsikt i hvordan STORM fungerer vi presentere utarbeidelsen av tre testprøvene og metodikk for å hente og prosessere STORM super-oppløsning med typiske oppløsning på mellom 30-50 nm. Ved å kombinere de testprøver med bruk av den fritt tilgjengelige prosessregnstorm programvare er det mulig å oppnå en stor mengde informasjon om bildekvalitet og oppløsning. Ved hjelp av disse beregningene er det da mulig å optimalisere bilde prosedyren fra optikken, til prøveopparbeidelse, fargestoff valg, bufferforhold, og bildetakingsinnstillinger. Vi enLSO viser eksempler på noen vanlige problemer som resulterer i dårlig bildekvalitet, for eksempel lateral drift, der prøven beveger seg under bildeopptak og tetthet relaterte problemer som resulterer i "mislocalization"-fenomenet.
Nylig ble en rekke optiske mikroskopi teknikker har blitt utviklet, vanligvis referert til som superoppløsning mikroskopi eller nanoscopy, som kan omgå diffraksjon grensen og generere bilder med en oppløsning på 100 nm eller bedre 1,2. Siden kunngjøringen av super-oppløsning mikroskopi som Nature Metoder metoden av året i 2008, har det vært en stor utvikling av lokaliseringsbaserte mikroskoper. For eksempel er det multi-farge programmer 3-6, 3D-implementeringer 7-12, og selv levende celle applikasjoner 5,13-17. Videre, ettersom disse systemene blir kommersialisert og er nå på vei ut av optikk laboratorier i hendene på cellebiologer er det sannsynlig å være en ytterligere økning i bruken og søknad til biomedisinske spørsmål.
En gren av denne familien er de lokaliseringsbaserte metoder som fungerer ved å bygge opp et bilde molekyl-by-molekyl. Jegn For å gjøre dette, må det meste av fluorescerende molekyler i prøven være slått av, slik at bare et par romlig-atskilte molekyler som er aktive på et gitt tidspunkt. Disse molekylene blir deretter raskt slås av og på, og mange bilder er tatt, slik at en betydelig del av befolkningen blir fotografert for å reflektere den underliggende strukturen med sub-diffraksjon presisjon. Det er publisert en rekke tilnærminger, inkludert GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 og RESOLFT 22. Algoritmer som måler posisjonen til et enkelt deteksjonsmolekyl kan så brukes til å finne den faktiske posisjon av molekylet med presiseringer bedre enn 20 nm ved bruk av gaussisk fitting 23, for eksempel rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 og 27. regnstorm. Ved å avbilde celler eller andre biologiske prøver, som har en høy molekyl tetthet, er det derfor nødvendig å ta tusenvis av rammerdenne blinker, romlig separert, signal for å image en betydelig andel av de merkede molekyler.
Stokastisk optisk gjenoppbygging mikroskopi (STORM) og den svært relatert dSTORM og GSDIM metoder er lokaliseringsbaserte super-oppløsning metoder, som har vist seg å arbeide med kommersielt tilgjengelige organiske fargestoffer 21. Det har siden blitt vist å være anvendelig til en rekke forskjellige fargestoffer 28 til 30, noe som gjør metoden spesielt attraktive på grunn av den relative spesifisitet og bekvemmeligheten av veletablerte immunolabeling fremgangsmåter for å utføre fluorescens-mikroskopi. Følgelig, det er lett tilgang til et utvalg av fargestoff-antistoff og fargestoff-biomolekyl konjugater, som har potensiale til å bli brukt i super-oppløsning avbildning lokaliseringsbasert. Mens de generelle prinsippene for STORM og lignende tilnærminger er relativt enkel, og ved første øyekast maskinvare og prøveopparbeidelse synes relativt straightforward, er det en rekke av trinnene i prosessen som er avgjørende for å oppnå høy kvalitet, artefakt-free, bilder super-oppløsning.
Som med alle mikroskopi teknikker prosessen kan betraktes i tre hovedtrinn: bildebehandling bildeanalyse og tolkning første, prøveopparbeidelse, andre, image oppkjøpet, og tredje, og / eller. Den ekstra oppløsningsevne og metode for generering av super-oppløsning ved hjelp av en lokalisering basert tilnærming introduserer noen nye problemer og hensyn 31-33. Fra og med prøvepreparering, ved utføring immunolabeling, særlig indirekte immunfluorescens, hvor et primært og sekundært antistoff kombinasjonen anvendes, bør det bemerkes at det fluorescerende fargestoff kan være opp til 20 nm bort fra molekylet av interesse. I tilfelle av mikrotubuli, resulterer dette i en diameter på 35 til 50 nm, sammenlignet med en forventet microtubule diameter på 25 nm 28,30. I tillegg bør merking tetthet mEET Nyquist kriterier for å generere en høy bildekvalitet 14. For eksempel for en forventet bildeoppløsning på 20 nm langs en trådformede strukturen bør det være et fargestoff molekyl minst hver 10 nm 27. Mens mange fargestoffer har blitt publisert for å arbeide for lokalisering baserte tilnærminger den generelle ytelsen av fargestoff er en blanding av minst fire viktige kriterier, nemlig oppdaget fotoner pr bytte event (lysstyrke hver blink – lysere er bedre), likevekt på -off duty cycle (kontrastforhold på fargestoffer i off versus på staten – mer av er generelt bedre), overlevelse fraksjonen (en lav bleking rente er bedre), og antall bytter sykluser (antall blink per fluoroforen – mer er bedre for høy oppløsning, selv om en blink pr fluoroforen kan være en fordel for molekyl telleformål). Situasjonen blir ytterligere komplisert ved det faktum at disse egenskaper for et gitt fargestoff kan variere i forskjellige bufferbetingelser ogmed laser makt 28,29. Dessuten, i tillegg til disse unike STORM betraktninger, bildekvalitet kan forbedres ved å optimalisere prøvepreparering på samme måte som mer tradisjonelle fluorescens mikroskopi teknikker, for eksempel ved å minimere autofluorescens ved modifisering av fikseringsbetingelser og ved bruk av slukke reagenser. Dessuten reduserer ikke-spesifikt bundne fluoroforer er viktig, noe som kan gjøres ved å justere konsentrasjonen etikett, inkubasjonstider og blokkering, og vasketrinnene.
Det andre trinnet av bildet oppkjøpet er også kritisk. De optimale innstillinger på mikroskopet, vil avhenge av fargestoff, buffer-betingelser, merking tetthet, og prøvetype, f.eks monolag på glass, celler eller vevsprøver. De viktigste hensyn er kamera eksponeringstid, rammenummer, belysning vinkel (TIRF, HILO, Epi) og laser makt. Målet er å samle så mange lyse romlig separerte blinker så raskt som mulig. Hvis bakgrunnen jegs meget høye eller den blinker ikke er meget lyse, med andre ord at signal-til-støyforholdet er dårlig, rekonstruksjon algoritmen vil ikke være i stand til å lokalisere posisjonen like nøyaktig. I tillegg til å maksimere lokaliseringspresisjon, det vil si presisjon med hvert molekyl posisjon kan måles, avhenger bildekvaliteten også på et høyt antall lokaliseringer. Hvis ikke tilstrekkelig antall molekyler av interesse blir fotografert, enten på grunn av dårlig merking effektivitet, overdreven fotobleking eller et utilstrekkelig bildenummer, da den resulterende super-oppløsning vil være punctate og usammenhengende som Nyquist kriterier vil ikke ha oppfylt 14,27 .
Og til slutt, i det tredje trinnet, bildebehandling, spesielt viktig i forhold til standard fluorescens mikroskopi-teknikker. Det er en rekke fritt og kommersielt tilgjengelige algoritmer, som er både en fordel, i form av valg, og en ulempe, i at det kan være forvirrende å vite which er mest hensiktsmessig å bruke. Hvis for eksempel rådata har godt fordelt romlig forskjellige blinker deretter en enkelt-molekyl montering algoritme kan være svært nøyaktig og effektiv, for eksempel ved sparsom sittende algoritmer tilgjengelig i regnstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 og QuickPALM 26 programvare . Hvis rådata inneholder mye overlappende signaler da algoritmer som kan være mer hensiktsmessig inkluderer DAOSTORM 34, 3B 35 og deconSTORM 36. Videre disse algoritmene inneholde terskler for ulike kriterier som signalet teller, eller fotoner pr blink, samt ulike bildevisningsalternativer som for eksempel visualisere med utjamna Gaussian funksjoner eller som histogrammer med piksel rutenett, der super-oppløsning pikselstørrelse kan være valgt av brukeren. Alle disse alternativene endre utseendet på det endelige bildet og har implikasjoner for bilde tolkning og analyse.
<p class="jove_content"> Derfor presenterer vi tre testprøver som vil gi den nye brukeren med et utgangspunkt for dye-basert lokaliseringsbaserte super-oppløsning eksperimenter, som for ordens skyld vil vi refererer til som STORM, og mer erfarne brukere muligheten til å optimalisere sine eksperimenter videre. For det første er det mulig å belegge overflaten av glass med et fluorescerende sjikt på dekstran-fargestoff-konjugatet. Dette gir en rask og enkel måte å fastslå at mikroskopet, fargestoff og buffer arbeider for å generere blinkende fluorescerende signal. Metoden kan deretter forlenges ved å sammenligne gjennomsnittlig lokalisering presisjon og tallberegninger generert av regnstorm å optimalisere bufferbetingelser, bildetakingsinnstillinger og teste ulike fargestoffer. For det andre presenterer vi en enkel protokoll for å forberede aktin filamenter på glass som lett kan merkes ved hjelp phalloidin-dye konjugater. Disse gir ideelle strukturer for å ta målinger av oppløsning 27 og vanligvis full bredde halv maksimum (FWHM)av en glødetråd er gitt som en empirisk estimat av oppløsningen 37.. Det skal bemerkes at oppløsningen varierer mellom prøvene og mellom bilder i den samme prøve, fordi oppløsningen i lokaliseringsbasert super-oppløsning mikroskopi er en funksjon av fluorofor lysstyrke, bakgrunnsstøy og lokalisering tetthet 27 og disse er ikke nødvendigvis konstante gjennom hele prøven. Aktin filamenter er vant til å demonstrere mulige gjenstander som mislocalizations og drift, og hvordan de kan identifiseres med programvarefunksjoner innenfor regnstorm. Videre beskriver vi bruk av fluorescerende fiducial markører til både mål og korrekt drift. Og for det tredje, er fargingen av celler med epidermal vekstfaktor (EGF)-fargestoff-konjugatene beskrevet. EGF gir en nyttig indikator på super-oppløsning bildeytelse, fordi en del av reseptoren på celleoverflaten gjennomgår endocytose via vesikler, som er sub-diffraksjon store strukturer av omtrent 50 til 150 nm i diameter 27,38,39.Vi viser med noen enkle prøver og den fritt-tilgjengelig behandling programvare Rainstorm det er mulig å optimalisere STORM super-oppløsning bildebehandling. Disse verktøyene og metodene vil gi nyttig utgangspunkt for nye brukere og måter for erfarne brukere å øke tilliten i sine mikroskoper og deres bruk av dem til å studere biologiske og cellulære strukturer med enestående detalj. Ved å bruke en kombinasjon av prøver med kjent eller godt forstått strukturer og en algoritme som kan produsere en rekke nyttige for bildekvalitet beregninger, for eksempel gjennomsnitts presisjon anslag, lokalisering nummer og histogrammer som viser det er mulig å forbedre bildekvaliteten, og til å ha større tillit i STORM bildebehandling prosessen. Det er ingen one-size fits all tilnærming til å anskaffe de data som det finnes en rekke ulike kommersielle og selvbygde mikroskop konfigurasjoner som kan brukes. Dessuten er det mange prøveopparbeidelse og bilde oppkjøpet skritt som kan innflytelseke endelige bildet derfor ha programvareverktøy og testprøver er kritisk for å forstå og optimalisere STORM bildekvalitet.
I tillegg disse protokollene kan gi nyttige og mindre tvetydige måter å feilsøke eventuelle problemer som kan oppstå. For eksempel dekstran prøven er en meget nyttig metode for å identifisere om det er noen laserstråle forskyvning eller ujevn belysning av prøven. Hvis det er bekymring for at svitsje buffer ikke kan jobbe en svært enkel visuell test for å se om det er noen "blinker" vil hjelpe. Aktin filamenter er en nyttig måte å måle oppløsning ved hjelp FWHM sammenligninger så vel som markerer drift og mislocalization gjenstander. Imidlertid bør det bemerkes at som lokaliseringsbasert super-resolusjonsmetoder kan være følsomme fluorofor densitet, uten hensyn til andre medvirkende faktorer, slik som eksponeringstider, bildefrekvens, laser krefter og den måten den bilde som skal behandles, er det umulig å tildele en oppløsning til enspesielt mikroskop og anta at alle bildene skal ha den oppløsningen. Det er imidlertid mulig å måle forskjellige aspekter av oppløsning slik som midlere lokaliserings presiseringer, lokalisering nummer og drift 27. Selv om fiducial markører ikke kan innarbeides i alle eksperimenter de kan, i det minste, brukes for å karakterisere et mikroskop system, sitt miljø og bedre forstå operative hensyn, for eksempel hvor mye tid som er nødvendig for å nå termisk likevekt etter oppstart. I tillegg til å korrigere for sideveis avdrift, kan fiducial markørene brukes for å karakterisere og korrigere for aksial drift, selv om dette krever bruk av et astigmatisk linse og en tilbakekoblingsmekanisme for å løse prøven stilling mens bildene blir ervervet 43.. Kommersielle super-oppløsningssystemer vil vanligvis inneholde noen form for stabilitetskontroll eller fokus-låsemekanisme, som kan være en mer praktisk løsning for å korrigere fokus drift.
Det enre alternativ til ikke-spesifikt å belegge glasset med dextran, for eksempel ved hjelp av fargestoffer som direkte eller andre konjugerte molekyler, slik som sekundære antistoffer. En begrensning av disse metodene er at antall molekyler bundet til glasset ikke er kjent. Alternative trådformede strukturer som har blitt brukt er mikrotubuli 28 og DNA 21. Imidlertid var kombinasjonen av meget liten størrelse og praktisk kommersielt tilgjengelige reagenser gjør aktin et attraktivt alternativ, særlig når avstanden av avvikende eller forgrenede filamenter kan også være et nyttig mål på systemytelse 27..
Det er rom for ytterligere utvikling av testprøver, til tross for nylig fremgang på dette området 28,29,46,47. Spesielt presenterer multi-farge bildebehandling en rekke utfordringer i alle tre hoveddelene av bildebehandling, sample merking, image oppkjøpet (hardware), og programvare (bildebehandling og justering). Det har en værten rekke publikasjoner som omhandler disse aspektene 4-6 og det er derfor klart at hensiktsmessige prøver og metoder er avgjørende for å generere og pålitelig måte å tolke denne typen bilder. Faktisk, nylig ble det vist at dSTORM kunne brukes til å ta to fargebilder av, og løse, den svært symmetriske natur kjernefysiske pore komplekse og forfatterne antydet at dette ville være en ideell måte å vurdere resultatene av kromatisk aberrasjon korreksjoner 45. En annen interessant metode er å bruke DNA origami for å lage en nanoruler, noe som gir mulighet for posisjonering fluoroforer på bestemte sub-diffraksjon avstander fra hverandre 46. Dette gir en måte å vurdere oppløsning og gjør distanse. Imidlertid er det endelige mål er å anvende disse super-oppløsningsteknikker til ikke-idealiserte prøver, slik som celler, som er komplekse tredimensjonale strukturer. I dette tilfelle, en kombinasjon av mer grundig forståelse av than teknikk kombinert med programvareverktøy som hjelper brukeren i å skaffe data, behandle den på riktig måte, og gir bilde beregninger er sannsynlig å være den ultimate svaret. 28,29,47,48
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner midler fra kjemisk og biologisk Justervesenet program av Storbritannias National Måling Office. Vi takker Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi og Eric Rees for tekniske råd og forslag. Vi takker Miklos Erdelyi, Eric Rees og Max Ryadnov for nyttige kommentarer og diskusjoner om dette manuskriptet.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |