Fonctionnement d'un bioréacteur de laboratoire

Summary

Fermenteurs sont utilisés pour augmenter le rendement de la culture et la productivité des cellules transgéniques. Après le dépistage multiples microbiennes ou animales candidats de culture de cellules dans des flacons agités, la prochaine étape logique est d'augmenter la biomasse de la culture sélectionnée avec le fermenteur. Cette vidéo montre l'installation et le fonctionnement d'un système de bioréacteur de paillasse typique.

Abstract

Les systèmes de fermentation sont utilisés pour fournir un environnement optimal pour la croissance de nombreux types de cultures de cellules. La possibilité offerte par des fermenteurs de contrôler avec soin la température, le pH et les concentrations en oxygène dissous, en particulier, les rend indispensables à la croissance à grande échelle efficace et l'expression de produits de fermentation. Cette vidéo décrire brièvement les avantages de la cuve de fermentation au cours de la fiole d'agitation. Il permettra également d'identifier les éléments clés d'un système de fermentation de paillasse typique et donner des instructions sur la configuration de base de la cuve et l'étalonnage de ses sondes. Le spectateur sera familiarisé avec le procédé de stérilisation et montré comment inoculer le milieu de croissance dans le récipient de culture. Les concepts de base de fonctionnement, l'échantillonnage et la récolte seront également démontrés. Analyse de données simple et nettoyage du système seront également discutées.

Introduction

La technologie de fermentation de base est une extension de la technique simple de flacon d'agitation pour cultures en croissance. Il est né de la volonté de contrôler les environnements de croissance pour cultures vivantes d'une manière plus complète et quantitative. Lot flacons culture d'agitation sont généralement limitées par le contrôle de la température imprécise. Uniformité de la température dans un shaker incubés ou salle chaude est très variable, parfois s'égarer 5 ° C ou plus de la valeur de consigne destinée. Etant donné que le flacon d'agitation est généralement agité à une vitesse fixe, la consommation d'oxygène et de gaz d'échange est limité. Une fois l'oxygène ambiant disponible est épuisé, la plupart des cultures ne parviennent pas à se développer. Il n'ya pas de contrôle du pH dans des flacons agités. Dans de nombreux cas, si la culture n'est pas limitée par la charge d'alimentation, il devient acide au point de nuire à la culture et la respiration ralentit considérablement. La plupart des cultures en flacons agités sont également fonctionner comme un «lot», ce qui signifie qu'ils sont alimentés seulement une fois au niveau ou à proximité du début des cultures inoculation. Après cette source de carbone initiale est consommée, la culture cesse de croître. Dans certains cas, son métabolisme peut changer et commencer à consommer d'autres métabolites dans le bouillon de culture, parfois de modifier les caractéristiques de la biomasse ou de la protéine résultante. des flacons d'agitation sont aussi généralement soumis à des médias perte par évaporation dans des environnements de culture plus chaudes, généralement 10% du volume par 24 heures à 37 ° C. Cette perte change la densité de la culture et interdit un fonctionnement plus long terme du système. Enfin, l'utilisateur peut rencontrer moussant des médias après l'agitation. L'apparition de mousse dans le vide au-dessus de la culture permettra de limiter les échanges gazeux et la croissance du grasset.

Le système de fermentation de base est conçu pour répondre à toutes ces limitations. Contrôle soigneux de la température est réalisée dans des cuves de fermentation par l'utilisation de la turbine d'agitation et d'une enveloppe chauffante. Capteur inséré dans le récipient et les informations de contrôle de chauffage et de refroidissement de cette enveloppe habituellementrésultats dans le contrôle de la température ± 0,1 ° C autour de la consigne. Fermenteurs de paillasse fournissent généralement un contrôle de pH par addition de réactif liquide par une pompe. La valeur du pH est contrôlée en permanence dans le but de maintenir un environnement optimal pour la croissance cellulaire. Une bonne aération est maintenue par l'impulseur de mélange mentionné ci-dessus ou par l'injection d'air ou d'oxygène gazeux additionné directement dans la culture. Avec des cultures sensibles au cisaillement, de l'oxygène gazeux additionné est le principal mécanisme de maintien de niveau d'oxygène dans la culture. La mesure de l'oxygène dans la solution est généralement obtenue par une sonde polarographique qui n'est pas normalement disponible pour une utilisation dans des flacons agités. Il est également possible d'ajouter en continu ou périodiquement dans la cuve d'alimentation pour maintenir la croissance de manière linéaire ou exponentielle. Le condenseur de gaz de sortie fournit une surface froide de la vapeur dans le flux de gaz d'échappement pour condenser, préservant ainsi le volume de la culture et de la densité. Addition périodique d'agent tensio-actif antimousse est actionnéepar une sonde de conductivité dans la culture, la réduction de la mousse sur la surface et en permettant l'échange de gaz.

Le navire, avec toutes les sondes, raccords, roues, tuyaux de récolte, et des tubes, est assemblé et stérilisé dans un autoclave standard. Après l'étalonnage de la sonde et de la stabilisation définitive de l'environnement d'exploitation, la culture est introduite dans le récipient. Le système peut alors être utilisé pour caractériser la culture d'une manière qui est plus quantitative et précise qu'avec un procédé par agitation du flacon. Un contrôle strict de la température, le pH, la teneur en oxygène, la consommation de nourriture, l'évaporation du liquide, et les niveaux de mousse contribuent tous à une biomasse bien plus élevée et un meilleur rendement en protéines.

Protocol

1. Commencer à fonctionner avec l'installation de la cuve. Un fermenteur classique présente les composants suivants qui doivent être installées (figure 1):
   1. sonde de pH - pour la mesure du pH dans la culture vivante. Calibrer la sonde avant l'installation et stériliser avec le navire. Installez la sonde dans la plaque frontale.
   2. pO ₂ sonde - pour la mesure de la teneur en oxygène dissous à l'intérieur de la cuve pendant la fermentation. Installez la plaque frontale.
   3. tuyau de récolte pour l'échantillonnage de la culture. Installez ce composant réglable en hauteur dans la plaque frontale.
   4. Gaz de barbotage - réside dans le bas de la cuve et permet la perfusion de gaz à la culture. Crochet de barbotage jusqu'à la source de gaz sur la cuve de fermentation et de monter dans la plaque de tête.
   5. arbre de la roue et de la roue - la roue remue la culture et est essentiel pour le maintien de la culture uniformité dans la cuve.
   6. Condenseur de gaz d'échappement - pour l'arrêt de la perte par évaporation dans la cuve de refroidissement par le chemin de gaz d'échappement.
   7. les lignes de la pompe de réactif pour le contrôle du pH ou l'addition d'alimentation.
2. Nettoyer la cuve et plaque de tête avec de l'eau et du savon. Une brosse douce est recommandé pour le nettoyage de la cuve et plaque de tête. Bleach ou nettoyants au chlore ne peuvent pas être utilisés pour nettoyer la cuve.
3. Si le support n'est pas thermolabile, l'ajouter à la cuve propre. Seulement ajouter jusqu'à volume de travail maximal est atteint. Dans ce cas, le volume de travail maximal est de 3,3 L pour un récipient de volume total de 5 L.
4. Montez la plaque frontale de la cuve, veiller à ce que le joint torique est bien en place.
5. Installer le condenseur de gaz d'échappement.
6. Installez la sonde anti-mousse dans son port de 10 mm.
7. Installez le tuyau de la récolte dans son port de 10 mm. Mettez un morceau de tuyau sur le dessus et serrer le tout.
8. Installer un tube et d'un filtre 0,20 um à l'entrée d'aspersion puis serrer cette option.
9. Étalonner la sonde de pH:
   1. Rassembler 2 tampons de référence en petits béchers, une bouteille de lavage et un wa rechangesh bécher.
   2. Accrocher la sonde de pH à la fermentation et tourner le fermenteur sur.
   3. Faites défiler jusqu'au paramètre de pH et en utilisant le bouton de menu, faites défiler jusqu'à l'option 'Cal' et appuyez sur 'Entrée'.
   4. Sélectionnez '2 'pour l'étalonnage de 2 points.
   5. Laver l'extrémité de la sonde et plonger dans la mémoire tampon de référence faible. La valeur sur le fermenteur va se stabiliser. Utilisation de la touches + et -, réglez la valeur affichée en fonction de la valeur de la mémoire tampon de référence de pH. Une fois qu'il arrête de clignoter, appuyez sur "Entrée".
   6. Lavez la sonde et insérez-la dans le deuxième tampon de référence. Laissez la valeur de stabiliser puis utilisez le clavier pour faire la valeur affichée correspond à la valeur de tampon de référence élevée. Appuyez sur "Entrée" pour confirmer.
   7. Laver la pointe de la sonde hors tension et débranchez-le de la cuve de fermentation. Mettez le capuchon de protection sur la connexion et l'installer dans la plaque frontale.
10. Ouvrez la pointe de la sonde pO ₂ et vérifiez qu'il n'yest assez électrolyte pour couvrir la pointe. Si non, ajouter un peu vers le réservoir et fermez-le vers le haut.
11. Installez la sonde pO ₂ dans la plaque frontale et assurez-vous que le bouchon de l'autoclave est mis sur la protection de ses connexions électriques. Il sera calibré après la stérilisation.
12. Obtenir un flacon destiné à l'alimentation de réactif avec un tube plongeur et le filtre à air. Ajouter tuyau de pompe à l'orifice du tube plongeur et fixer l'autre extrémité à l'orifice d'entrée sur le fermenteur.
13. Lieu tube sur tous les ports inutilisés serrer ensuite le tube hors tension.
14. Installer un filtre de 0,45 um sur le condenseur de gaz d'échappement. Ce filtre permet de s'assurer que le récipient n'a pas sous pression dans l'autoclave.
15. Vérifiez que tous les tubes qui vont au-dessous du niveau des médias sont serrés au large pour empêcher les médias de sortir.
16. Mettez le récipient dans l'autoclave pour 25 - 30 min à 121 ° C, cycle de liquide. Attention: Quand il sort, il sera très chaud.
17. Installez le navire sur la base du fermenteur.
18. Branchez le pHsonder câble.
19. Branchez le câble de la sonde pO _2.
20. Accrocher le diffuseur à la rotamètre de plus de gaz.
21. Ajouter stérilement réactif 1 M de NaOH à la bouteille avec le tube plongeur et installer la tête de pompe sur la broche de la tête de pompe de base.
22. Mettre le capteur de température dans le tube de protection sur la plaque de tête. Assurez-vous que il va tout le chemin vers le bas du doigt de gant.
23. Abaissez le bras de l'agitation sur le couplage des navires de la roue.
24. Assurez-vous que le fermenteur est sur.
25. Vérifier que l'eau est à la disposition du fermenteur.
26. Ouvrir l'alimentation en air de la cuve de fermentation.
27. Faites défiler jusqu'au paramètre de la température et régler la température à 37 ° C. Appuyez sur la touche "Entrée" pour démarrer le contrôle de la température. Le navire va chauffer à 15 min ou moins.
28. Tournez le flux de gaz à 1 volume de la cuve de médias par minute ou moins. Dans cette configuration, le flux de gaz est de 3 L / min. Bulles doivent apparaître au bas.
29. Faites défiler jusqu'à l'agitation parameter et mis à 300 rpm. Appuyez sur "Entrée" pour activer l'agitation.
30. Une fois que la température a atteint 37 ° C, faites défiler jusqu'au paramètre de pH et le mettre à 6,8. Tournez la commande de pH en appuyant sur le bouton 'Entrée'.
31. Set agitation à la vitesse maximum de 1000 tours par minute pendant la course.
32. Assurez-vous que la sonde pO ₂ est polarisée correctement pour afficher les valeurs appropriées. Après 2 heures, faites défiler jusqu'au paramètre pO ₂ et utiliser le bouton «Menu» pour sélectionner le «Fonction Calibrer» et sélectionnez le calibrage de 1 point.
33. Après 15 minutes, utiliser les curseurs pour régler la valeur à 100 et appuyez sur "Entrée". Ce sera étalonner pO _2.
34. Faites défiler à l'agitation et mis à 300 rpm.
35. En utilisant le bouton «Menu», tournez la 'Cascade' à 'on' dans le menu de l'agitation. Cela augmentera la vitesse d'agitation dans un effort pour hacher les bulles d'air et forcer plus d'oxygène dans la solution en tant que demande de croissance augmente.
36. Faites défiler jusqu'au paramètre pO ₂ et définir la valeur à 30. Appuyez sur la touche "Entrée" pour démarrer pO _2.
37. Démarrez le logiciel de commande sur le PC.
38. Une fois que les sondes sont étalonnées, l'agitation est stable à 300 tours par minute, la température est à 37 ° C et le pH est proche de 6,8, il est temps pour inoculer. L'utilisation de l'alcool, stériliser le port qui sera utilisé pour l'inoculation.
39. Dessinez l'inoculum dans une seringue et l'ajouter dans le port stérilisé. Fermer le port.
40. Marquez le moment de l'inoculation dans un journal de bord.
41. Il est également important de prendre un échantillon au moment de la stérilisation. Stériliser l'extrémité du tube de canalisation de la récolte avec de l'alcool.
42. Ouvrez la pince couvrant le port de la récolte et utiliser une seringue pour prélever un échantillon. Ce premier échantillon est généralement écartée car elle a été assis dans le tuyau.
43. Utilisez une autre seringue pour tirer un autre échantillon.
44. Avec une troisième seringue, pousser l'air à travers le tuyau d'enlever autant de volume mortde la ligne et serrer le hors ligne.
45. Déterminer la densité de cellules et de pH et d'enregistrer les valeurs. Avec des cultures microbiennes, il est utile d'identifier les valeurs toutes les heures. Intervalle est dépendante de la culture.
46. méthodologie de récolte dépend de l'intention de la culture après la croissance est terminée. Dans ce cas, un échantillon de la culture finale de temps pour recevoir des valeurs de point de terminaison pour la densité des cellules et du pH ou de la mesure du possible de poids de cellules humides. Ouvrez la plaque frontale disposé du contenu dans un "réservoir de kill" désigné avec l'eau de Javel ou d'autres agents antimicrobiens.

Results

Le bioréacteur peut être exécuté avec ou sans le logiciel IRIS. Cependant, pour capturer des données, il est préférable d'utiliser le logiciel. Avant l'addition de bactéries, le pH et l'oxygène capteurs doivent être étalonnés, l'ensemble de la vitesse du rotor et la consigne de la température. Sur la figure 2, la sortie de données pour une course de bioréacteur est présenté. La température a été réglée à 30 ° C, la vitesse de l'agitateur à 200 rpm. Les paramètres peuvent être différents pour chaque expérience, mais avant l'addition de bactéries, le système devrait être à l'état stationnaire. Sur la figure 3, la variation de la concentration en oxygène avec l'addition de la culture bactérienne est signalée. Les points de consigne pour cette expérience sont 37 ° C, d'un agitateur à 200 rpm, O ₂ à 70%. Au temps 19 heures 20, la pompe d'alimentation délivre la culture d'ensemencement bactérien à une DO de 0,1 provoquer une chute dans le niveau immédiatement O _2. Le bioréacteur répond au changement de niveau _de O ₂ avec une augmentation du débit d'air et la vitesse turbine. Til a créé des points pour les augmentations sont fixées dans la cascade (étape 35). Le réacteur pH a été contrôlé en temps réel, avec la diminution du pH puis augmentant comme démontré par la fluctuation de la ligne de pH au cours du temps (figure 4). La série entière peut être analysé et ajusté les paramètres pour les expériences ultérieures.

Figure 1. Bioréacteur de laboratoire avec toutes les parties marquées et connectés. Cette figure montre le réacteur à cuve agitée, au début d'une course. Les pièces du réacteur sont étiquetés et comprennent les capteurs, roue, jauge de température, des bouteilles d'alimentation et d'échantillonnage, l'orifice d'échappement, manomètre de pression d'air, chemise de chauffage, tour de condenseur, et le panneau de commande.

Figure 2. l'image de l'écran de bioréacteur software au début du terme. Au début d'un cycle de cuve agitée, la température est réglée à 30 ° C (ligne jaune), la vitesse du rotor à 200 rpm (ligne rouge), le pH à 6.5 (ligne verte), et pO ₂ à 57,2% (ligne bleue). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. l'image de l'écran d'un logiciel de bioréacteur lors de l'exécution en tant oxygène diminue. Lorsque la culture est en phase de croissance active, il consomme de l'oxygène et de la quantité d'oxygène dans le réacteur est diminuée (ligne bleue). En augmentant la vitesse de la roue, plus d'oxygène peut être ajouté à la culture (ligne rouge). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. l'image de l'écran d'un logiciel de bioréacteur montrant le changement de pH au cours du temps. Le pH de la culture est surveillée en continu et le temps, il diminue à mesure que l'acide lactique est produit, puis augmente à mesure que la base est ajoutée au bioréacteur (ligne bleue). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Bioréacteurs à cuve agitée sont la norme dans l'industrie de la biotechnologie et ont été utilisés depuis plus de 40 ans ^1. La petite cuve agitée a été important pour l'échelle, à échelle réduite, l'optimisation de la souche, la caractérisation et le développement de processus. Elle peut aussi avoir un rôle important dans le développement de la médecine individualisée ^2. Le bioréacteur à petite échelle est la plus semblable à des conditions in situ de la croissance de la cellule, car il peut être contrôlé et optimisé tout au long de la course. Le plus souvent, des expériences initiales sont effectuées en utilisant des flacons d'agitation, mais les conditions dans le bioréacteur à petite échelle diffèrent de manière significative de la fiole d'agitation. Dans une expérience, nous avons trouvé que les conditions pour une croissance optimale de E. coli et à la production de la protéine fluorescente verte (GFP) dans le flacon d'agitation ne se traduisent pas sur le bac à agitation (données non publiées).

D'autres méthodes de croissance de cellules à grande échelle comprennent des bouteilles à rouleaux, seul use bascule bioréacteurs de la plate-forme ³ et grands bioréacteurs à usage unique avec des volumes de travail de 50 à 5000 L. Chaque méthode fournit des défis à l'échelle supérieure, mais a trouvé une place dans la production. L'utilisation seule plate-forme à bascule bioréacteur est similaire à la cuve agitée, et fournit un environnement régulé. Elle diffère de la cuve agitée en ce que le mélange se produit en raison d'un mouvement de bascule pour générer des ondes à empêcher le dépôt de cellules et de fournir l'oxygénation. L'hydrodynamique pour ce procédé sont différents de la cuve à agitation et le volume maximal est limité à 1 000 L. Les différences peuvent influer sur la croissance cellulaire et la production de produits. D'autres systèmes à usage unique combinent la cuve agitée avec le réacteur jetable, fournir une plate-forme avec un minimum d'infrastructure et les frais généraux associés, et la capacité de haut débit bioprocédés ^4.

Les nouveaux utilisateurs de bioréacteurs de paillasse peuvent avoir du mal à déterminer les consignes initiales de pH, pO ₂ et températuretempérature, mais les recherches publiées peut être référencé pour cette information ^{5, 6, 7, 8, 9.} Avec des cultures bactériennes en particulier, il est recommandé de commencer l'agitation à la même vitesse que le flacon à secousses et la température à la même valeur de consigne. pH de la culture à partir de fioles d'agitation par secousses précédentes pistes peut également être utilisé en tant que point de départ. Réglage de la valeur pO ₂ est plus difficile et est généralement déterminée de manière empirique. Cependant, à partir de 50% pO ₂ est un point de départ recommandée.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB bouillon	Sigma	L3022
ampicilline	Sigma	A1593-25G
LB bouillon	Sigma	L3022
antimousse 204	Sigma	A8311
1 M Hydroxyde de sodium	Sigma	38215-1EA-R
Tampon de référence, pH 4.00	Sigma	B5020
Référence Tampon, pH 7,00	Sigma	B4770
sonde d’électrolyte pO2	Broadley James	AS-3140-C30-0025
Filtre 0,45 micron	Cole Parmer	EW-02915-22
Filtre 0,22 micron	Cole Parmer	EW-29950-40
Seringue Luer Lock, 10 mL	Cole Parmer	EW-07940-12
Bioréacteur Minifors	Infors HT	B-Pack 5.0
Air Admiral pompe à air	Cole Parmer	EW-79202-00
1175 Circulateur de refroidissement	VWR	13721-204