Isolation, rensning og mærkning af museknoglemarv Neutrophils for Funktionelle Studier og adoptiv overføring Experiments

Summary

Vi beskriver en protokol til isolering og oprensning af neutrofiler fra mus knoglemarv ved densitetsgradientcentrifugering og neutrofil mærkning hjælp CellTracker farvestoffer. Dette udgør en enkel, hurtig, reproducerbar og økonomisk metode til opnåelse af store antal neutrofiler til downstream funktionelle undersøgelser eller adoptiv overførsel og sporing eksperimenter.

Abstract

Neutrofiler er kritiske effektorceller i det medfødte immunsystem. De er hurtigt rekrutteret på steder af akut inflammation og udøve beskyttende eller patogene virkninger afhængigt af den inflammatoriske miljø. Ikke desto mindre er trods den uundværlige rolle neutrofiler i immunitet, detaljeret forståelse for de molekylære faktorer, der medierer neutrofiler 'effektor og immunopathogenic effekter i forskellige smitsomme sygdomme og inflammatoriske tilstande stadig mangler, dels på grund af deres korte halveringstid, vanskelighederne med håndtering af disse celler og mangel på pålidelige forsøgsprotokoller for at opnå et tilstrækkeligt antal neutrofiler for downstream funktionelle undersøgelser og adoptiv overførsel eksperimenter. Derfor enkel, hurtig, økonomisk og pålideligt metoder er særdeles ønskeligt for at høste tilstrækkeligt antal mus neutrofiler til vurdering af funktioner såsom fagocytose, drab, cytokinproduktion, degranulation og menneskehandel. Med henblik herpå,præsenterer vi en reproducerbar densitetsgradientcentrifugering-baseret protokol, der kan tilpasses i alle laboratorier at isolere et stort antal neutrofiler fra knoglemarven hos mus med høj renhed og levedygtighed. Desuden præsenterer vi en enkel protokol, der anvender CellTracker farvestoffer til at mærke de isolerede neutrofiler, som derefter kan adoptivt overføres til recipientmus og spores i flere væv i mindst 4 timer efter overførsel ved anvendelse af flowcytometri. Med denne fremgangsmåde kan differentieret mærkning af neutrofiler fra vildtype-og-gendeficient mus med forskellige CellTracker farvestoffer held kan anvendes til at udføre konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser for at vurdere den direkte rolle af specifikke gener i handel med neutrofiler fra blodet ind i målvæv in vivo .

Introduction

Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter hos mennesker. De er det vigtigste cellulære komponent af det medfødte immunsystem og fungere som en første forsvarslinje mod invaderende mikroorganismer. Patienter med erhvervet neutropeni og primære immundefekter, der påvirker neutrofile tal og / eller funktion udvikle livstruende invasive bakterie-og svampeinfektioner, fremhæver betydningen af disse celler i værtsforsvar ^1.. Immungenkendelse af invaderende patogener på infektionsstedet ved deres beslægtede mønstergenkendelse receptorer resulterer i induktionen af en organiseret medfødt immunrespons, som fører til sekretion af kemoattraktanter, der genererer en kemotaktisk gradient kan rekruttere neutrofiler fra blodbanen ind i det betændte væv ² . Efter neutrofiler ind i infektionsstedet, de bliver aktiveret, hvilket fører til cytokinproduktion og chemokin produktion, patogen optagelse og drab via oxidativ og ikke-oxidative migchanisms ^3.. Udover deres velkendt rolle i medfødte immunitet, har neutrofile også for nylig blevet vist at spille vigtige roller som initiativtagere på effektive adaptive immunrespons ^4.. På den anden side, bortset fra deres beskyttende roller i immunitet neutrofile også medierer vævsskade og immunopatologi grund af overdreven ophobning og / eller aktivering ved steder med inflammation, som vist i en række smitsomme sygdomme og autoimmunsygdomme ^5-7.

På trods af den uundværlige rolle neutrofiler i montering effektive medfødte immunrespons og deres pleiotropiske effektor funktioner i flere infektionssygdomme og betændelsestilstande tekniske vanskeligheder med håndtering af disse celler og mangel på pålidelige forsøgsprotokoller har hindret forskning neutrofiler over de seneste årtier. Derfor bør brug af reproducerbare assays til isolering af neutrofiler fremme yderligere forskning i neutrofil-medieret immunologiske funktioner ex vivo og in vivo. Til dato har adskillige fremgangsmåder blevet beskrevet til isolering af neutrofiler, såsom densitetsgradientcentrifugering af humant blod og mus blod eller knoglemarv ^8,9, positiv eller negativ immunomagnetisk berigelse af neutrofiler fra mus blod eller knoglemarv ^10,11, og høst af neutrofiler fra bughulen af mus efter intraperitoneal injektion af Thioglycollat ​​eller andre inflammatoriske midler ^12.. Selvom neutrofiler kan let isoleres i store mængder fra humant blod, denne metode er ikke optimal i mus på grund af den begrænsede mængde af museblod der udelukker isolering af tilstrækkelige neutrofiler til funktionelle undersøgelser eller adoptiv overføring eksperimenter ^13.. Desuden celler fra bughulen selvom udbyttet af Thioglycollat-fremkaldte er større sammenlignet med mus blod, renheden af ​​neutrofiler i inflammatoriske peritoneumudskylning varierer mellem60-90%, og de isolerede neutrofiler udviser en aktiveret fænotype. Således opsamles cellerne ved hjælp af denne metode kan kun bruges til at udføre funktionelle studier af aktiverede, men ikke af ustimulerede neutrofiler, som musen bughulen har få neutrofiler ved steady state ^12. I stedet knoglemarven er en bekvem reservoir til høst stort antal enten stimulerede eller aktiverede neutrofiler ^11,14, som derefter kan bruges til efterfølgende funktionelle undersøgelser såsom fagocytose, drab og degranulation eller til adoptiv overførsel til recipientmus.

Heri beskriver vi en enkel og hurtig (~ 2 hr) protokol, der giver et højt udbytte (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrofiler / ikke-inficerede mus, eller op til 30-40 × 10 ⁶ neutrofiler / inficerede mus) ren (80 -95%) neutrofiler med> 95% levedygtighed fra knoglemarven. Denne metode bruger kommercielt tilgængelige Histopaque, som er densitetsgradient celle særskiltration medier bestående af Ficoll og natrium diatrizoat, at adskille neutrofiler fra knoglemarven hos mus. Denne metode giver betydeligt større antal neutrofiler pr mus sammenlignet med blod eller bughulen, kan det bruges til at indsamle neutrofiler fra mus både ved steady state eller efter infektion, og det er lettere at lag i forhold til densitetsgradientcentrifugering metode, der bruger diskontinuert Percoll gradienter bestående af 55% / 65% / 75% Percoll i PBS ^9.. Desuden er den tid og de ressourcer, der kræves for at indsamle rene neutrofile faldet betydeligt i forhold til neutrofil isolation hjælp fluorescens-aktiveret celle sortering. Også fordi denne metode ikke indebærer en immunomagnetisk berigelse trin, det er mere omkostningseffektivt, og den undgår eksponering af celler til den magnetiske spalte og antistoffer og derved mindske sandsynligheden for neutrofilaktivering.

Ud over at udføre funktionelle undersøgelser af isolerede neutrophils ex vivo og adoptiv overførsel af celler i recipientmus, denne protokol beskriver også en metode til mærkning af isolerede neutrofiler ved hjælp af forskellige CellTracker farvestoffer. Differential mærkning af neutrofiler fra mus af forskellige genetiske baggrunde kan tilpasses i konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser til sporing af overførte neutrofiler i væv af recipientmus ved anvendelse af flowcytometri, som kan give mekanistisk indsigt om direkte rolle af specifikke gener i handel med neutrofiler fra blodet i mål betændte organer ^6..

Protocol

1.. Isolering af knoglemarvsceller hos mus Aflive mus ved anvendelse af institutionens dyrepleje udvalg-godkendte protokol og spray dyret overflade med 70% ethanol. Lave et snit i huden i midten maven og fjerne skindet fra den distale del af musen, herunder huden, der dækker de nedre ekstremiteter. Skær musklerne fra underekstremiteterne med en saks og omhyggeligt forskubbe acetabulum fra hofteleddet, og samtidig undgå at bryde lårbenshovedet. Fjerne de resterende muskler fra…

Representative Results

Denne protokol er optimeret til høst af knoglemarvsceller fra mus og den efterfølgende adskillelse af neutrofiler fra disse celler ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af kommercielt tilgængelige Histopaque celleadskillende medier. Neutrofiler isoleres ved anvendelse af denne metode kan anvendes til en række aftagere funktionelle studier ex vivo og til adoptiv transfer eksperimenter i recipientmus. Den typiske udbytte af indsamling af knoglemarvsceller fra både …

Discussion

Heri præsenterer vi en pålidelig, enkel, hurtig og økonomisk protokol til isolering af store antal neutrofiler fra knoglemarven af ​​mus med høj renhed og levedygtighed under anvendelse af en densitetsgradientcentrifugering tilgang. Når denne protokol udføres korrekt, kan ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrofiler udvindes fra en ikke-inficerede mus og så mange som ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrofiler kan isoleres fra en mus efter infektion ^6. De isolerede neutrofiler er 80-95% rene og> 95% levedyg…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.