Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Abstract

Neutrophile sind kritische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. Sie werden sich schnell an den Standorten der akuten Entzündung rekrutiert und üben Schutz-oder pathogenen Wirkungen in Abhängigkeit von der entzündlichen Milieu. Dennoch ist trotz der unverzichtbaren Rolle von Neutrophilen in Immunität, detailliertes Verständnis der molekularen Faktoren, die Neutrophilen 'Effektor-und immunpathogenen Effekte in verschiedenen Infektionskrankheiten und entzündlichen Erkrankungen vermitteln noch fehlt, teils wegen ihrer kurzen Halbwertszeit, die Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle für den Erhalt ausreichender Zahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Daher sind einfache, schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methoden sehr wünschenswert für die Ernte eine ausreichende Zahl von Neutrophilen Maus für die Beurteilung Funktionen wie Phagozytose, Tötung, Zytokin-Produktion, Degranulation und Menschenhandel. Zu diesem ZweckWir stellen eine reproduzierbare Dichtegradientenzentrifugation-basiertes Protokoll, das in jedem Labor eine große Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit isolieren angepasst werden kann. Darüber hinaus präsentieren wir ein einfaches Protokoll, das CellTracker Farbstoffe verwendet, um die isolierte Neutrophile, die dann in adoptiv Empfängermäuse übertragen werden können und verfolgt in mehreren Geweben für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung mittels Durchflusszytometrie zu beschriften. Mit diesem Ansatz können Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden, um wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien zur Bewertung der direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Zielgewebe in vivo durchführen .

Introduction

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten in den Menschen. Sie sind die wichtigsten zellulären Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Patienten mit Neutropenie und erworbenen primären Immundefekten, die Neutrophilen Zahlen und / oder Funktion beeinflussen entwickeln lebensbedrohlicher invasiver Bakterien-und Pilzinfektionen, die Bedeutung dieser Zellen in Wirtsabwehr ^1. Immune Anerkennung eindringende Pathogene am Ort der Infektion durch ihren verwandten Muster-recognition receptors Ergebnisse in der Induktion einer orchestrierten angeborenen Immunantwort, die Sekretion von Lockstoffe, die eine chemotaktische Gradienten in der Lage Recruiting Neutrophilen aus der Blutbahn in das entzündete Gewebe ² Leads zu generieren . Nach Neutrophilen Ort der Infektion geben, sie aktiviert werden, führt das zu Zytokin-und Chemokin-Produktion, pathogen-Aufnahme, und die Tötung durch oxidative und nicht-oxidative michchanismen ^3. Neben ihrer allgemein anerkannten Rolle in der angeborenen Immunität, haben Neutrophilen auch vor kurzem gezeigt, dass eine wichtige Rolle als Initiatoren der effektiven adaptive Immunantworten ⁴ spielen. Auf der anderen Seite, abgesehen von ihrer protektiven Immunität in Rollen kann auch Neutrophile vermitteln Gewebeverletzung und Immunpathologie durch übermäßige Akkumulation und / oder Aktivierung an entzündeten Stellen, wie sie in einer Vielzahl von Infektions-und Autoimmunerkrankungen ^5-7 gezeigt.

Trotz der unverzichtbaren Rolle der Neutrophilen bei der Montage wirksam angeborenen Immunantwort und ihre pleiotropen Effektor-Funktionen in mehreren Infektionskrankheiten und Entzündungen, technische Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle hat die Forschung mit neutrophilen Granulozyten in den letzten Jahrzehnten behindert. Daher sollte die Verwendung von reproduzierbaren Tests zur Isolierung von Neutrophilen weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelte Immunologie erleichterngischen Funktionen ex vivo und in vivo. Bisher wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen wie Dichtegradientenzentrifugation von menschlichem Blut und Maus Blut oder Knochenmark ^8,9, positive oder negative immunomagnetische Anreicherung von Neutrophilen Maus Blut oder Knochenmark ^10,11 beschrieben wurde, und das Ernten von Neutrophilen aus der Peritonealhöhle von Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Thioglycolat oder andere entzündungshemmende Mittel ^12. Obwohl Neutrophilen kann leicht in großen Stückzahlen aus menschlichem Blut isoliert werden, ist diese Methode nicht optimal in den Mäusen infolge des geringen Volumens Mäuseblut die Isolierung von Neutrophilen ausreichend für funktionelle Studien oder adoptiven Transfer Experimente ¹³ ausschließt. Darüber hinaus, obwohl die Ausbeute an Thioglycolat-induzierte Zellen aus der Bauchhöhle größer ist verglichen mit der Maus Blut variiert die Reinheit von Neutrophilen in den entzündlichen Peritoneallavage zwischen60-90%, und die isolierten Neutrophilen zeigen einen aktivierten Phänotyp. Somit erfasst die Zellen unter Verwendung dieses Verfahren nur zur Durchführung funktionelle Untersuchungen aktivierten verwendet werden, nicht aber von nicht stimulierten Neutrophilen, die Maus Bauchhöhle wenigen Neutrophilen im stationären Zustand ^12. Stattdessen wird das Knochenmark ein bequemer Reservoir für die Ernte eine große Zahl von entweder stimulierten oder aktivierten Neutrophilen ^11,14, die dann stromabwärts funktionellen Studien wie Phagozytose Tötung und Degranulation oder für die adoptive Transfer in Empfänger-Mäuse verwendet werden.

Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (~ 2 Stunden)-Protokoll, das eine hohe Ausbeute liefert (~ 6-12 × 10 ⁶ Neutrophile / infizierten Maus oder bis zu 30-40 × 10 ⁶ Neutrophile / infizierten Maus) reines (80 -95%) Neutrophilen mit> 95% Rentabilität aus dem Knochenmark. Diese Methode verwendet handelsübliche Histopaque, die Dichtegradienten Zelle getrennt sindRation Medien aus Ficoll und Natriumdiatrizoat, an Neutrophile aus dem Knochenmark von Mäusen zu trennen. Dieses Verfahren ergibt wesentlich größere Anzahl von Neutrophilen pro Maus im Vergleich zu Blut oder Bauchhöhle, kann es verwendet werden, um Neutrophile von Mäusen sowohl im stationären Zustand oder nach der Infektion gesammelt werden, und es ist einfacher zu Schicht im Vergleich zu der Dichtegradientenzentrifugation Verfahren die diskontinuierliche verwendet Percoll Gradienten, bestehend aus 55% / 65% / 75% Percoll in PBS ^9. Darüber hinaus werden die Zeit und die Ressourcen, die zur reinen Neutrophilen sammeln signifikant im Vergleich zu Neutrophilen Trennung mittels Fluorescence-Activated Cell Sorting verringert. Da auch dieses Verfahren nicht auf einer immunomagnetischen Anreicherungsschritt ist es kostengünstiger und vermeidet die Exposition von Zellen gegenüber der magnetischen Spalte und Antikörper, dh verringert die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung von Neutrophilen.

Zusätzlich zur Durchführung funktionelle Studien an isolierten neutrophils ex vivo und adoptiven Transfer von Zellen in Empfängermäuse, dieses Protokoll beschreibt auch ein Verfahren zur Kennzeichnung von isolierten Neutrophilen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe. Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Mäusen verschiedener genetischer Hintergründe können im Leistungssport Wiederbesiedlung Studien für die Verfolgung der übertragenen Neutrophilen im Gewebe des Empfängers Mäusen mittels Durchflusszytometrie, die mechanistischen Einblick in die direkte Rolle bestimmter Gene kann in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut angepasst werden Ziel in entzündeten Organen ^6.

Protocol

1. Isolierung von Knochenmarkszellen der Maus Euthanize Mäusen unter Verwendung des Organs Tierpflege-Ausschuss genehmigten Protokoll und sprühen das Tier Oberfläche mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt der Haut in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, welche die unteren Extremitäten. Schneiden Sie die Muskeln der unteren Extremitäten mit einer Schere und sorgfältig verrücken die Pfanne aus dem Hüftgelenk, bei gleich…

Representative Results

Dieses Protokoll ist für die Ernte von Knochenmarkszellen von Mäusen und die anschließende Trennung von Neutrophilen aus diesen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation mit handelsüblichen Histopaque Zellseparation Medien optimiert. Neutrophile isoliert mit dieser Methode kann für eine Vielzahl von nachgelagerten funktionelle Studien ex vivo und für adoptiven Transfer Experimente in Mäusen Empfänger verwendet werden. Die typische Ausbeute der Sammlung von Knochenmarkzelle…

Discussion

Hier präsentieren wir eine zuverlässige, einfach, schnell und wirtschaftlich-Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit mit einer Dichtegradientenzentrifugation Ansatz. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, kann ~ 6-12 × 10 ⁶ Neutrophile von einer nicht infizierten Maus gewonnen werden und bis zu ~ 30-40 × 10 ⁶ Neutrophilen kann aus einer Maus nach der Infektion ⁶ isoliert werde…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.