अलगाव, शोधन और कार्यात्मक अध्ययन और दत्तक स्थानांतरण प्रयोगों के लिए माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल का लेबल
Summary
हम घनत्व ढाल centrifugation द्वारा और CellTracker रंगों का उपयोग न्युट्रोफिल लेबलिंग के लिए माउस अस्थि मज्जा से neutrophils के अलगाव और शुद्धीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. यह नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन या दत्तक हस्तांतरण और ट्रैकिंग प्रयोगों के लिए neutrophils की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए एक सरल, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और किफायती तरीका का प्रतिनिधित्व करता है.
Abstract
न्यूट्रोफिल सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की आलोचना effector कोशिकाओं हैं. वे तेजी से तीव्र सूजन की साइटों में भर्ती और भड़काऊ परिवेश के आधार पर सुरक्षात्मक या रोगजनक प्रभाव डालती रहे हैं. बहरहाल, विभिन्न संक्रामक रोगों और भड़काऊ शर्तों में जीवाणुओं 'प्रेरक और immunopathogenic प्रभाव मध्यस्थता कि आणविक कारकों की प्रतिरक्षा, विस्तृत समझ में neutrophils की अनिवार्य भूमिका के बावजूद अभी भी आंशिक रूप क्योंकि उनके कम आधा जीवन, इनमें से निपटने के साथ कठिनाइयों की कमी है, कोशिकाओं और नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन और दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए neutrophils की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए विश्वसनीय प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की कमी है. इसलिए, सरल, तेजी से किफायती और विश्वसनीय तरीकों ऐसे phagocytosis, हत्या, cytokine उत्पादन, degranulation और तस्करी के रूप में कार्य का आकलन करने के लिए माउस neutrophils की पर्याप्त संख्या कटाई के लिए अति आवश्यक हैं. कि अंत करने के लिए,हम उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता के साथ चूहों की अस्थि मज्जा से जीवाणुओं की बड़ी संख्या को अलग करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में रूपांतरित किया जा सकता है जो एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घनत्व ढाल centrifugation आधारित प्रोटोकॉल, उपस्थित थे. इसके अलावा, हम फिर adoptively प्रवाह cytometry का उपयोग कम से कम 4 घंटे के बाद हस्तांतरण के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कर दिया और कई ऊतकों में लगाया जा सकता है जो अलग neutrophils, लेबल करने CellTracker रंगों का उपयोग करता है कि एक साधारण प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, विभिन्न CellTracker रंगों के साथ जंगली प्रकार और जीन की कमी चूहों से neutrophils के अंतर लेबलिंग सफलतापूर्वक vivo में लक्ष्य ऊतकों में रक्त से neutrophils की तस्करी में विशिष्ट जीन की प्रत्यक्ष भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिस्पर्धी repopulation अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है .
Introduction
न्यूट्रोफिल मनुष्यों में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं. वे सूक्ष्मजीवों पर हमले के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली और अधिनियम के मुख्य सेलुलर घटक हैं. न्युट्रोफिल संख्या और / या कार्य प्रभावित है कि अधिग्रहीत neutropenia और प्राथमिक immunodeficiencies साथ मरीजों मेजबान बचाव 1 में इन कोशिकाओं के महत्व पर प्रकाश डालते हुए जीवन के लिए खतरा आक्रामक बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण, विकास. सूजन के ऊतकों 2 में खून से भर्ती neutrophils के सक्षम chemotactic ढाल उत्पन्न कि chemoattractants का स्राव होता है, जो एक करवाया सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के शामिल होने में उनके आत्मीय पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स परिणामों से संक्रमण स्थल पर रोगजनकों पर हमले की प्रतिरक्षा मान्यता . जीवाणुओं के संक्रमण स्थल में प्रवेश करने के बाद, वे सक्रिय हो जाते हैं, जो साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन, रोगज़नक़ तेज की ओर जाता है, और oxidative और गैर oxidative मुझे के माध्यम से हत्याchanisms 3. सहज प्रतिरक्षा में उनकी अच्छी तरह से पहचाना भूमिका के अलावा, जीवाणुओं को भी हाल ही में प्रभावी अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4 के initiators के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. 5-7 संक्रामक और autoimmune रोगों की एक किस्म के रूप में दिखाया दूसरी ओर, अलग प्रतिरक्षा में उनकी सुरक्षा भूमिकाओं से, जीवाणुओं भी, अत्यधिक संचय और / या सूजन की साइटों पर सक्रियण के कारण ऊतक चोट और इम्युनोपैथोलोजी मध्यस्थता कर सकते हैं.
बढ़ते प्रभावी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और कई संक्रामक रोगों और भड़काऊ शर्तों, विश्वसनीय प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के इन कोशिकाओं और कमी से निपटने के साथ तकनीकी कठिनाइयों में उनके pleiotropic प्रेरक कार्यों में neutrophils की अनिवार्य भूमिका के बावजूद पिछले दशकों में जीवाणुओं के साथ अनुसंधान रुकावट है. इसलिए, neutrophils के अलगाव के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays के उपयोग न्युट्रोफिल की मध्यस्थता immunolo पर और अधिक अनुसंधान की सुविधा चाहिएgical कार्यों पूर्व vivo और इन विवो में. तिथि करने के लिए, कई तरीकों जैसे मानव रक्त का घनत्व ढाल centrifugation और माउस रक्त या अस्थि मज्जा 8,9, माउस रक्त या अस्थि मज्जा 10,11 से neutrophils की सकारात्मक या नकारात्मक immunomagnetic संवर्धन के रूप में neutrophils के अलगाव के लिए वर्णित है, और कटाई की गई है thioglycollate या अन्य भड़काऊ एजेंट 12 की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद चूहों की peritoneal गुहा से neutrophils की. जीवाणुओं आसानी से मानव रक्त से बड़ी संख्या में अलग किया जा सकता है, इस विधि कार्यात्मक अध्ययन या दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों 13 के लिए पर्याप्त neutrophils के अलगाव precludes कि माउस रक्त की सीमित मात्रा के कारण चूहों में suboptimal है. की उपज thioglycollate-हासिल हालांकि इसके अलावा, peritoneal गुहा से कोशिकाओं माउस खून की तुलना में अधिक है, भड़काऊ पेरिटोनियल पानी से धोना में neutrophils की पवित्रता के बीच होती है60-90%, और अलग neutrophils के एक सक्रिय फेनोटाइप दिखा रहे हैं. इस प्रकार, कोशिकाओं माउस peritoneal गुहा स्थिर राज्य के 12 में कुछ जीवाणुओं के रूप में इस विधि केवल सक्रिय के कार्यात्मक अध्ययन के प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन नहीं unstimulated neutrophils की जा सकता है का उपयोग कर एकत्र की. इसके बजाय, अस्थि मज्जा तो ऐसे phagocytosis, हत्या और degranulation, या प्राप्तकर्ता चूहों में दत्तक हस्तांतरण के रूप में नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो या तो unstimulated या सक्रिय neutrophils, 11,14, के बड़ी संख्या में कटाई के लिए एक सुविधाजनक जलाशय है.
इस के साथ साथ हम एक उच्च उपज प्रदान करता है जो एक सरल और तेजी से (~ 2 घंटा) प्रोटोकॉल का वर्णन (~ 6-12 × 10 6 जीवाणुओं / असंक्रमित माउस, या ऊपर 30-40 तक × 10 6 जीवाणुओं / संक्रमित माउस) शुद्ध (80 से -95%) अस्थि मज्जा से> 95% व्यवहार्यता के साथ जीवाणुओं. इस विधि घनत्व ढाल सेल अलगाववादी हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Histopaque, का उपयोग करता हैFicoll और सोडियम diatrizoate से मिलकर राशन मीडिया, चूहों की अस्थि मज्जा से जीवाणुओं को अलग करने के लिए. इस विधि रक्त या peritoneal गुहा की तुलना में माउस प्रति neutrophils की काफी बड़ी संख्या में पैदावार, यह स्थिर अवस्था में या संक्रमण के बाद दोनों चूहों से जीवाणुओं को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह टूटनेवाला का उपयोग करता है कि घनत्व ढाल centrifugation विधि की तुलना में परत करने के लिए आसान है किया जा सकता है 55% / 65% / पीबीएस 9 में 75% Percoll से मिलकर Percoll ढ़ाल. इसके अलावा, समय और शुद्ध जीवाणुओं को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक संसाधनों की काफी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी का उपयोग कर न्युट्रोफिल अलगाव की तुलना में कम कर रहे हैं. इसके अलावा, इस पद्धति का एक immunomagnetic संवर्धन कदम को शामिल नहीं करता है, क्योंकि यह अधिक लागत प्रभावी है, और यह इस प्रकार न्युट्रोफिल सक्रियण की संभावना कम है, चुंबकीय स्तंभ और एंटीबॉडी के लिए कोशिकाओं के जोखिम से बचा जाता है.
पृथक neutroph के कार्यात्मक अध्ययन के प्रदर्शन के अलावाआइएलएस पूर्व vivo और प्राप्तकर्ता चूहों में कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण, इस प्रोटोकॉल भी अलग CellTracker रंगों का उपयोग पृथक neutrophils की लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है. विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों से neutrophils के अंतर लेबलिंग खून से neutrophils की तस्करी में विशिष्ट जीन की प्रत्यक्ष भूमिका पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो प्रवाह cytometry, का उपयोग कर प्राप्तकर्ता चूहों के ऊतकों में स्थानांतरित कर जीवाणुओं पर नज़र रखने के लिए प्रतिस्पर्धी repopulation पढ़ाई में रूपांतरित किया जा सकता है लक्ष्य सूजन अंगों 6 में.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ हम एक घनत्व ढाल centrifugation दृष्टिकोण का उपयोग उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता के साथ चूहों की अस्थि मज्जा से जीवाणुओं की बड़ी संख्या के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय, सरल, तेज और किफायती प्रोटोकॉल उपस्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), संयुक्त राज्य अमेरिका के अंदर का रिसर्च डिवीजन के द्वारा समर्थित किया गया था.
सभी चूहों एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) में प्रयोगशाला पशु की देखभाल से मान्यता प्राप्त जानवरों की सुविधा के प्रत्यायन के लिए एक अमेरिकन एसोसिएशन में बनाए रखा है और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित प्रक्रियाओं के अनुसार रखे जाते थे NIAID के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तत्वावधान में.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
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