Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.
Neutrofili sono cellule critiche effettrici del sistema immunitario innato. Sono rapidamente reclutati ai siti di infiammazione acuta e esercitano effetti protettivi o patogeni seconda del milieu infiammatorio. Tuttavia, nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel sistema immunitario, la comprensione dettagliata dei fattori molecolari che mediano gli effetti effettrici e immunopatogenici neutrofili 'in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie che ancora manca, in parte a causa della loro breve emivita, le difficoltà con la gestione di questi celle e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili per ottenere un numero sufficiente di neutrofili per studi funzionali a valle e gli esperimenti di trasferimento adottivo. Pertanto, metodi semplici, veloci, economici e affidabili sono altamente desiderabile per la raccolta di un numero sufficiente di neutrofili del mouse per valutare funzioni quali la fagocitosi, l'uccisione, la produzione di citochine, degranulazione e il traffico. A tal fine,vi presentiamo un protocollo riproducibile gradiente di densità centrifugazione a base, che può essere adattato in qualsiasi laboratorio per isolare un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità. Inoltre, vi presentiamo un semplice protocollo che utilizza coloranti CellTracker per etichettare i neutrofili isolati, che possono poi essere trasferiti adoptively in topi riceventi e monitorati in diversi tessuti per almeno 4 ore post-trasferimento in citometria a flusso. Usando questo approccio, l'etichettatura differenziale dei neutrofili da topi wild-type e gene-deficienti con diversi coloranti CellTracker può essere impiegato con successo per eseguire studi di ripopolamento della concorrenza per valutare il ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue nei tessuti bersaglio in vivo .
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nell'uomo. Essi sono la principale componente cellulare del sistema immunitario innato e ad agire come una prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. I pazienti con neutropenia acquisita e immunodeficienze primarie che interessano i numeri dei neutrofili e / o funzione di sviluppare infezioni invasive potenzialmente letali batteriche e fungine, mettendo in evidenza l'importanza di queste cellule in serie della difesa 1. Riconoscimento immune di patogeni nel sito dell'infezione dai loro cognate di riconoscimento di recettori risultati nella induzione di una risposta immunitaria innata orchestrato, che porta alla secrezione di fattori chemiotattici che generano un gradiente chemiotattico capace di reclutare neutrofili dal sangue nel tessuto infiammato 2 . Dopo neutrofili entrano nel sito dell'infezione, diventano attivate, che porta a citochine e chemochine, assorbimento patogeno, e uccidendo via ossidativa e non ossidativa mechanisms 3. Oltre al loro ruolo ben riconosciuto nella immunità innata, i neutrofili sono stati anche recentemente dimostrato di svolgere ruoli importanti come iniziatori di efficaci risposte immunitarie adattative 4. D'altra parte, a prescindere dai loro ruoli protettivi nell'immunità, neutrofili possono anche mediare il danno tissutale e immunopatologia causa di un eccessivo accumulo e / o l'attivazione ai siti di infiammazione, come mostrato in una varietà di malattie infettive e autoimmuni 5-7.
Nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel montaggio efficaci risposte immunitarie innate e le loro funzioni effettrici pleiotropici in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie, difficoltà tecniche con la gestione di queste cellule e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili ha ostacolato la ricerca con neutrofili nel corso degli ultimi decenni. Pertanto, l'uso di test riproducibili per l'isolamento dei neutrofili dovrebbe facilitare ulteriormente la ricerca sui mediato dai neutrofili immunologicigica funzioni ex vivo e in vivo. Ad oggi, diversi metodi sono stati descritti per l'isolamento dei neutrofili come la densità centrifugazione in gradiente di sangue umano e mouse o midollo osseo 8,9, arricchimento immunomagnetico positivo o negativo di neutrofili dal sangue o midollo osseo del mouse 10,11, e raccolta di neutrofili dalla cavità peritoneale di topi dopo iniezione intraperitoneale di tioglicolato o altri agenti infiammatori 12. Sebbene neutrofili possono essere facilmente isolati in gran numero da sangue umano, questo metodo è subottimale nei topi a causa delle ridotte dimensioni di sangue topo che preclude l'isolamento dei neutrofili sufficienti per studi funzionali o esperimenti trasferimento adottivo 13. Inoltre, anche se la resa di tioglicolato-suscitato cellule dalla cavità peritoneale è maggiore rispetto a quella del sangue topo, la purezza dei neutrofili nel lavaggio peritoneale infiammatoria varia tra60-90%, ed i neutrofili isolati esibiscono un fenotipo attivato. Così, le cellule raccolte mediante questo metodo può essere utilizzato solo per l'esecuzione di studi funzionali di attivazione, ma non di neutrofili non stimolati, come la cavità peritoneale del mouse ha pochi neutrofili alla stato stazionario 12. Invece, il midollo osseo è un serbatoio per la raccolta conveniente tantissimi sia non stimolate o attivati neutrofili 11,14, che possono poi essere utilizzati per studi funzionali valle come fagocitosi, uccisione e degranulazione, o per il trasferimento adottivo in topi riceventi.
Qui descriviamo un semplice e veloce (circa 2 ore) il protocollo, che prevede un alto rendimento (~ 6-12 × 10 6 neutrofili / topo infetto, o fino a 30-40 × 10 6 neutrofili / topo infetto) di puro (80 -95%) con neutrofili> 95% della vitalità dal midollo osseo. Questo metodo utilizza commercialmente disponibile Histopaque, che sono cellule gradiente di densità sepasupporti razione composto da Ficoll e diatrizoato sodio, per separare i neutrofili dal midollo osseo di topi. Questo metodo fornisce significativamente più grande numero di neutrofili per topo rispetto al sangue o cavità peritoneale, può essere utilizzata per raccogliere neutrofili da topi sia in stato stazionario o dopo l'infezione, ed è più facile strato rispetto al metodo di centrifugazione in gradiente di densità che utilizza discontinuo gradienti percoll composto da 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Inoltre, il tempo e le risorse necessarie per raccogliere i neutrofili puri sono significativamente diminuiti rispetto all'isolamento dei neutrofili mediante Fluorescence-Activated cella Ordinamento. Inoltre, poiché questo metodo non comporta un passaggio di arricchimento immunomagnetico, è più conveniente, ed evita l'esposizione delle cellule a colonna magnetica e anticorpi, diminuendo così la probabilità di attivazione dei neutrofili.
Oltre a eseguire studi funzionali di neutroph isolatoils ex vivo e il trasferimento adottivo di cellule in topi riceventi, questo protocollo descrive anche un metodo per l'etichettatura dei neutrofili isolati utilizzando diversi coloranti CellTracker. Etichettatura differenziale dei neutrofili da topi di vari background genetico può essere adattato in studi ripopolamento competitivi per il monitoraggio dei neutrofili trasferiti nei tessuti di topi riceventi tramite citometria a flusso, che può fornire la comprensione meccanicistica sul ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue in bersaglio organi infiammati 6.
Qui vi presentiamo un semplice protocollo affidabile, veloce ed economico per l'isolamento di un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità utilizzando un approccio di centrifugazione in gradiente di densità. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrofili possono essere recuperati da un mouse non infetto e fino a ~ 30-40 × 10 6 neutrofili possono essere isolati da un topo dopo l'infezione 6. I neutrofili is…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di ricerca intramurale del Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID), National Institute of Health (NIH), Stati Uniti d'America.
Tutti i topi sono stati mantenuti ad una Associazione americana per l'accreditamento del Laboratorio stabulario accreditato cura degli animali presso l'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) e alloggiati in conformità con le procedure descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio sotto gli auspici di un protocollo approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIAID.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
Materials | |||
C57BL/6 mice | Taconic | ||
15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
Equipment | |||
Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |