분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링
Summary
우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.
Abstract
호중구는 타고난 면역 시스템의 중요한 효과기 세포입니다. 그들은 빠르게 급성 염증의 사이트에서 모집하고 염증 환경에 따라 보호 또는 병원성 효과를 발휘합니다. 그럼에도 불구하고, 다른 전염성 질환 및 염증성 조건에서 호중구의 '음향과 immunopathogenic 효과를 중재하는 분자 요인의 면역 자세한 이해 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 아직도 부분적으로 때문에 그들의 짧은 반감기, 이들의 처리에 어려움, 부족한 세포 및 다운 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 호중구의 충분한 숫자를 얻기위한 신뢰성있는 실험 프로토콜의 부족. 따라서, 간단하고, 빠르고, 경제적이며 신뢰할 수있는 방법은 식균 작용, 살인, 시토 킨 생산, 탈과립 및 인신 매매 등의 기능을 평가하기위한 마우스 호중구 충분한 수의 수확에 매우 바람직하다. 이를 위해,우리는 높은 순도와 가능성과 생쥐의 골수에서 백혈구의 큰 숫자를 분리하는 어떤 실험실에서 적용 할 수있는 재생 밀도 기울기 원심 분리 기반의 프로토콜을 제시한다. 더욱이, 우리는 adoptively 유동 세포 계측법을 사용하여 적어도 4 시간 후 전송받는 생쥐에 옮겨와 여러 조직에서 추적 할 수있는 고립 된 호중구, 레이블 CellTracker 염료를 사용하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면 다른 CellTracker 염료와 야생형 유전자 결핍 생쥐에서 호중구의 차이 라벨이 성공적으로 생체 내 표적 조직에 혈액에서 호중구의 거래에서 특정 유전자의 직접적인 역할을 평가하기위한 경쟁력을 다시 채우기 연구를 수행하기 위해 고용 수 있습니다 .
Introduction
호중구는 인간의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 그들은 미생물 침입에 대한 방어의 첫 번째 라인으로 타고난 면역 시스템과 법의 주요 세포 구성 요소입니다. 호중구 수 및 / 또는 기능에 영향을 인수 호중구 감소증 및 기본 면역 부전 환자 호스트 방어 1이 세포의 중요성을 강조 생명을 위협하는 침입 세균 및 곰팡이 감염을 개발할 수 있습니다. 염증 조직 2에 혈류에서 채용 호중구 수있는 화성 그라데이션을 생성 chemoattractants의 분비로 연결 조율 타고난 면역 반응의 유도에 자신의 동족 패턴 인식 수용체 결과에 감염 사이트에서 병원균 침입의 면역 인식 . 호중구는 감염 사이트를 입력 한 후, 그들은 활성화되고, 이는 사이토 카인과 케모카인 생산, 병원균의 이해에 이르게하고, 산화 비 산화 나를 통해 살해chanisms 3. 타고난 면역 자신의 잘 인식 역할 외에, 호중구는 최근 효과적인 적응 면역 반응 4 개시로 중요한 역할을 보여왔다. 5-7 감염 및 면역 질환의 다양한 같이 다른 한편으로는, 떨어져 면역 자신의 보호의 역할에서, 호중구는 또한 과도한 축적 및 / 또는 염증의 사이트에서 활성화로 인한 조직 손상과 면역 병리를 중재 할 수 있습니다.
설치 효과적인 타고난 면역 반응과 여러 전염성 질환 및 염증, 신뢰성 실험 프로토콜이 세포 부족을 취급와 기술적 인 문제에서의다면 발현 이펙터 기능이있는 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 지난 수십 년 동안 호중구와 연구를 방해하고있다. 따라서 호중구의 분리에 대한 재현성 분석의 사용은 호중구 매개 immunolo에 대한 추가 연구를 촉진해야한다gical 기능 전직 생체 내 및 생체있다. 지금까지 여러 가지 방법이 같은 인간의 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 및 마우스 혈액이나 골수 8,9, 마우스 혈액이나 골수 10,11에서 호중구의 긍정적이거나 부정적인 면역 자기 농축으로 호중구의 분리에 대해 설명하고, 수확 한 thioglycollate이나 다른 염증성 에이전트 12의 복강 내 주입 후 생쥐의 복강에서 호중구. 호중구는 쉽게 인간의 혈액에서 큰 숫자에서 격리 할 수 있지만,이 방법은 기능 연구 또는 입양 전송 실험 13 충분한 호중구의 분리를 배제 마우스 혈액의 제한된 볼륨에 의한 생쥐에 최적입니다. 의 수율 thioglycollate가-이끌어하지만 또한 복강에서 세포가 쥐의 혈액에 비해 큰 경우 염증 복막 세척에서 호중구의 순도 사이에 차이가중가와 격리 된 호중구가 활성화 표현형을 나타냅니다. 따라서, 세포는 마우스 복강이 정상 상태 12에서 몇 가지 호중구가이 방법 만, 활성화의 기능 연구를 수행하는 데 사용하지만 자극받지 호중구 수 있습니다 사용하여 수집. 대신, 골수 그런 다음 식균 작용, 살인 및 탈과립, 또는받는 마우스로 입양 전송 등의 다운 스트림 기능을 연구에 사용할 수있는 하나 비자극 또는 활성화 된 호중구 11,14, 많은 수확을위한 편리한 저수지이다.
여기에 우리는 높은 수율을 제공하는 간단하고 빠른 (~ 2 시간) 프로토콜을 설명 (~ 6-12 × 10 6 호중구 / 감염 마우스 또는 최대 30-40 × 10 6 호중구 / 감염된 마우스) 순수 (80 -95 %), 골수에서> 95 % 생존율과 호중구. 이 방법은 밀도 기울기 세포 분리되어 있습니다 시중 Histopaque를 사용Ficoll 나트륨 diatrizoate 구성된 배급 매체는, 마우스의 골수에서 백혈구를 분리합니다. 이 방법은 혈액이나 복막 캐비티에 비해 마우스 당 호중구의 상당히 큰 숫자를 얻을, 그것은 정상 상태에서 또는 감염 후 두 생쥐에서 호중구를 수집하는 데 사용, 그것은 불연속을 사용하는 밀도 기울기 원심 분리 방식에 비해 레이어에 쉽게 할 수 있습니다 55 % / 65 % / PBS 9의 75 % Percoll로 구성된 Percoll 기울기. 또한, 시간과 순수한 호중구를 수집하는 데 필요한 자원이 크게 형광 활성화 된 셀 정렬을 사용하여 호중구의 분리에 비해 감소된다. 또한,이 방법은 면역 자기 농축 단계를 포함하지 않기 때문에,보다 비용 효율적이며, 따라서 호중구 활성화의 가능성을 감소, 자기 열에 항체에 세포의 노출을 방지 할 수 있습니다.
고립 neutroph의 기능 연구를 수행하는 이외에ILS 생체 및받는 생쥐에 세포의 입양 전송이 프로토콜은 서로 다른 CellTracker 염료를 사용하여 격리 된 호중구의 레이블하는 방법을 설명합니다. 다양한 유전 적 배경 생쥐에서 호중구의 차이 라벨은 혈액에서 호중구의 인신 매매의 특정 유전자의 직접적인 역할에 대한 기계론의 통찰력을 제공 할 수있는 유동 세포 계측법을 사용하여받는 사람 쥐의 조직에서 전송 된 호중구를 추적하기위한 경쟁 재 증식 연구에 적용 할 수 있습니다 대상 염증 기관 6에.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 우리는 밀도 기울기 원심 분리 방식을 사용하여 고순도 생존과 생쥐의 골수에서 호중구의 큰 숫자의 절연을위한 신뢰성, 빠르고 간단하고 경제적 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜이 올바르게 수행 될 때, ~ 6-12 × 10 6 백혈구는 감염 마우스에서 복구 할 수 있으며, 많은 ~으로 30 ~ 40 × 10 6 백혈구는 감염 후 6 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 격리 된 호중구 80-95 % ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID), 국립 보건 연구소 (NIH), 미국의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다.
모든 마우스는 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)에서 실험 동물 관리 공인 동물 시설의 인증을위한 미국 협회에서 관리 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 설명 된 절차에 따라 보관 하였다 NIAID의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜의 후원하에.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
