Isolering, rensing og merking av benmarg fra mus Nøytrofiler for funksjonelle studier og adoptivforeldre Transfer Eksperimenter

Summary

Vi beskriver en protokoll for isolering og rensing av nøytrofile granulocytter fra benmarg fra mus ved densitets-gradientsentrifugering og for nøytrofile merking ved hjelp CellTracker fargestoffer. Dette representerer en enkel, rask, reproduserbar og økonomisk metode for å skaffe et stort antall nøytrofile for nedstrøms funksjonelle studier eller adoptivforeldre overføring og sporing eksperimenter.

Abstract

Neutrofiler er kritiske effektorceller i det medfødte immunsystemet. De er raskt rekruttert på områder av akutt betennelse og utøve beskyttende eller patogene effekter avhengig av inflammatorisk miljø. Likevel er tross uunnværlig rolle av nøytrofile i immunitet, detaljert forståelse av molekylære faktorer som formidler nøytrofile 'effektor og immunopathogenic effekter i ulike infeksjonssykdommer og inflammatoriske tilstander fortsatt mangler, delvis på grunn av sin korte halveringstid, vanskelighetene med håndtering av disse celler og mangel på pålitelige eksperimentelle protokoller for å skaffe tilstrekkelig antall nøytrofile for nedstrøms funksjonelle studier og adoptivforeldre overføring eksperimenter. Derfor, enkel, rask, økonomisk og pålitelig metoder er svært ønskelig for høsting tilstrekkelig antall mus nøytrofile for å vurdere funksjoner som phagocytosis, drap, cytokin produksjon, degranulation og trafficking. For å nå dette målet,Vi presenterer en reproduserbar tetthetsgradient-sentrifugering-basert protokoll, som kan tilpasses i ethvert laboratorium for å isolere et stort antall neutrofiler fra benmargen hos mus med høy renhet og levedyktighet. Videre presenteres en enkel protokoll som bruker CellTracker fargestoffer for å merke de isolerte neutrofiler, som deretter kan overføres inn i mottaker-adoptively mus og sporet i en rekke vev i minst 4 timer etter overføringen ved hjelp av strømningscytometri. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan differensial merking av nøytrofile granulocytter fra villtype og gen-mangelfull mus med ulike CellTracker fargestoffer være vellykket ansatt for å utføre konkurransedyktige repopulation studier for å vurdere den direkte rolle for spesifikke gener i smugling av nøytrofile granulocytter fra blodet inn målet vev in vivo .

Introduction

Nøytrofile granulocytter er de mest tallrike leukocytter hos mennesker. De er den viktigste cellulære komponenten i det medfødte immunsystemet og fungere som en første forsvarslinje mot invaderende mikroorganismer. Pasienter med ervervet nøytropeni og primær immunsvikt som påvirker nøytrofile tall og / eller funksjon utvikle livstruende invasive bakterier og sopp, fremhever viktigheten av disse cellene i host forsvar ^en. Immune anerkjennelse av invaderende patogener ved infeksjon nettstedet av sine beslektede mønstergjenkjenning reseptorer resulterer i induksjon av en orkestrert medfødte immunforsvaret, noe som fører til utskillelse av chemoattractants som genererer en kjemotaktisk gradient i stand til å rekruttere nøytrofile granulocytter fra blodet inn i betent vev ² . Etter neutrofiler inn i området infeksjon, de blir aktivert, noe som fører til cytokinproduksjon og kjemokin produksjon, patogen opptak, og dreping via oksidative og ikke-oksidative mechanisms ^tre. Foruten sin godt anerkjent rolle i medfødt immunitet, har nøytrofile også nylig blitt vist seg å spille en viktig rolle som pådrivere i effektive adaptive immunresponser ^fire. På den annen side, bortsett fra deres beskyttende roller i immunitet, kan neutrofiler også mediere vevsskade og immunopathology grunn av overdreven opphopning og / eller aktivering ved områder av betennelse, slik som vist i en rekke infeksiøse og autoimmune sykdommer ^5-7.

Til tross for den uunnværlig rolle av nøytrofile granulocytter i montering effektive medfødte immunresponser og deres mitogen effektorfunksjoner i flere infeksjonssykdommer og inflammatoriske tilstander, tekniske problemer med håndtering av disse cellene og mangel på pålitelige eksperimentelle protokoller har hindret forskning med nøytrofile de siste tiårene. Derfor bør bruk av reproduserbare analyser for isolering av nøytrofile rette for videre forskning på nøytrofile-mediert immunologisk funksjon ex vivo og in vivo. Hittil har flere metoder blitt beskrevet for isolering av neutrofiler slik som tetthetsgradient-sentrifugering av humant blod og mus blod eller benmarg ^8,9, positiv eller negativ immunomagnetiske anrikning av nøytrofile granulocytter fra mus blod eller benmarg ^10,11, og høsting av nøytrofile granulocytter fra bukhulen til mus etter intraperitoneal injeksjon av thioglycollate eller andre ¹² inflammatoriske midler. Selv nøytrofile kan enkelt isolert i stort antall fra menneskeblod, er denne metoden suboptimal i mus på grunn av begrenset volum av mus blod som utelukker isolering av tilstrekkelig nøytrofile for funksjonelle studier eller adoptivforeldre overføring eksperimenter ^13. I tillegg, selv om utbyttet av thioglycollate-fremkalte celler fra bukhulen er større sammenlignet med mus blod, varierer renhet av nøytrofiler i den inflammatoriske peritoneal mellom lavage60-90%, og de isolerte nøytrofiler oppviser en aktivert fenotype. Således samles cellene ved hjelp av denne metode kan bare benyttes for å utføre funksjonelle studier av aktiverte, men ikke på neutrofiler unstimulated, som mus bukhulen har få neutrofiler i den stabile tilstanden ^12.. I stedet er benmargen en praktisk reservoar for høsting store mengder enten unstimulated eller aktivert nøytrofile ^11,14, som deretter kan brukes til nedstrøms funksjonelle studier som fagocytose, drap og degranulation, eller for adoptiv overføring til mottaker mus.

Heri beskriver vi en enkel og rask (~ 2 timer) protokollen, som gir en høy avkastning (~ 6-12 × 10 ⁶ nøytrofile / infiserte mus, eller opp til 30-40 × 10 ⁶ nøytrofile / infiserte mus) av ren (80 -95%) nøytrofile med> 95% levedyktighet fra benmargen. Denne metoden bruker kommersielt tilgjengelige Histopaque, som er tettshetsgradient celle separasjon media består av Ficoll og natrium diatrizoat, å skille nøytrofile fra benmargen hos mus. Denne metode gir betydelig større antall neutrofiler per mus sammenlignet med blod eller bukhulen, kan den brukes til å samle nøytrofiler fra mus både ved stabil tilstand eller etter infeksjon, og det er lettere å sjikt sammenlignet med tetthetsgradient-sentrifugering metode som anvender diskontinuerlige Percoll gradienter bestående av 55% / 65% / 75% Percoll i PBS ^9.. I tillegg er det tid og ressurser som kreves for å samle rene nøytrofile betydelig redusert sammenlignet med nøytrofile isolasjon med fluorescens-aktivert celle sortering. Også, fordi denne metode ikke innebærer en immunomagnetiske berikelse trinnet, er det mer kostnadseffektiv, og det unngår eksponering av celler til den magnetiske kolonne og antistoffer, og dermed redusere sannsynligheten for neutrofil aktivering.

I tillegg til å utføre funksjonelle studier av isolerte neutrophils ex vivo og adoptiv overføring av cellene inn i mottaker-mus, beskriver denne protokollen også en fremgangsmåte for merking av isolerte nøytrofiler ved hjelp av ulike CellTracker fargestoffer. Differential merking av nøytrofile granulocytter fra mus i ulike genetiske bakgrunn kan tilpasses i konkurranseutsatte repopulation studier for å spore de overførte nøytrofile i vev av mottakerlandene mus ved hjelp av flowcytometri, som kan gi mekanistisk innsikt på direkte rolle for spesifikke gener i smugling av nøytrofile granulocytter fra blodet inn mål betente organer ^seks.

Protocol

En. Isolering av Mouse benmargceller Avlive mus ved hjelp av institusjonens dyr omsorg komité-godkjent protokoll og spray dyret overflaten med 70% etanol. Gjøre et snitt i huden på midten av buk og fjerne huden fra den distale delen av mus inkludert huden som dekker de nedre ekstremiteter. Skjær av muskler fra nedre ekstremiteter med saks og forsiktig forskyve en acetabulum fra hofteleddet, og samtidig unngå å bryte femur hode. Fjern de resterende musklene fra femur og tibi…

Representative Results

Denne protokollen er optimalisert for høsting av beinmarg celler fra mus og den påfølgende separasjon av nøytrofile granulocytter fra disse cellene ved tettshetsgradient sentrifugering ved bruk av kommersielle Histopaque cellen separasjon media. Nøytrofiler isolert ved anvendelse av denne metode kan benyttes til en rekke nedstrøms funksjonelle studier ex vivo og for adoptive transfer eksperimenter i mottaker-mus. Den typiske utbytte av samlingen av benmargceller fra både lår…

Discussion

Heri vi presenterer en pålitelig, enkel, rask og økonomisk protokoll for isolering av et stort antall nøytrofile granulocytter fra benmargen hos mus med høy renhet og levedyktighet ved hjelp av en densitetsgradient sentrifugering tilnærming. Når denne protokollen er utført riktig, kan ~ 6-12 × 10 ⁶ nøytrofile gjenopprettes fra en infisert mus og så mange som ~ 30-40 × 10 ⁶ nøytrofile kan isoleres fra en mus etter smitte ^seks. De isolerte nøytrofile er 80-95% ren og> 95% l…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.