Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер
Summary
Мы опишем протокол для выделения и очистки нейтрофилов из костного мозга мыши центрифугированием в градиенте плотности и нейтрофилов мечение с применением CellTracker красителей. Это представляет собой простой, быстрый, воспроизводимые и экономичный способ получения большого количества нейтрофилов для последующих функциональных исследований или экспериментов приемных передачи и отслеживания.
Abstract
Нейтрофилы являются критическими эффекторные клетки врожденной иммунной системы. Они быстро набраны на участках острое воспаление и оказывают защитное или патогенных эффектов в зависимости от воспалительной среде. Тем не менее, несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в иммунитете, детальное понимание молекулярных факторов, которые обеспечивают нейтрофилов и эффекторные immunopathogenic эффектов в различных инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний по-прежнему отсутствует, отчасти потому, что их короткий период полураспада, трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов для получения достаточного количества нейтрофилов ниже по течению функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Таким образом, простой, быстрый, экономичный и надежный методы являются очень желательными для сбора достаточного количества нейтрофилов мыши для оценки функции, такие как фагоцитоз, убийства, продукция цитокинов, дегрануляцию и торговли людьми. С этой целью,Мы представляем воспроизводимый центрифугирования в градиенте плотности на основе протокола, который может быть адаптирован в любой лаборатории изолировать большое количество нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой степенью чистоты и жизнеспособности. Кроме того, предложен простой протокол, который использует CellTracker красителей для обозначения изолированных нейтрофилов, которые затем могут быть адаптивно переносили в мышей-реципиентов и отслеживаться в некоторых тканях, по крайней мере, 4 ч после передачи с использованием проточной цитометрии. Используя этот подход, дифференциальные маркировки нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышей с различными красителями CellTracker может быть успешно использован для выполнения конкурентоспособных исследований репопуляцию для оценки непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в ткани-мишени в естественных условиях .
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты 1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хемоаттрактанты которые генерируют градиента хемотаксических способны вербовку нейтрофилов из крови в воспаленную ткань 2 . После нейтрофилов ввести инфекцию сайт, они активизируются, что приводит к цитокинов и хемокинов, патоген поглощение, и убивают через окислительную и неокислительный меняchanisms 3. Кроме того, их хорошо узнаваемая роль во врожденном иммунитете, нейтрофилы также недавно было показано, играют важную роль в качестве инициаторов эффективной адаптивного иммунного ответа 4. С другой стороны, помимо их роли в защитный иммунитет, нейтрофилы могут также посредником повреждение тканей и иммунопатологии из-за чрезмерного накопления и / или активации на участках воспаления, как показано в различных инфекционных и аутоиммунных заболеваний 5-7.
Несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в монтаже эффективной врожденного иммунного ответа и их плейотропную эффекторных функций многих инфекционных заболеваний и воспалительных состояний, технические трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов препятствовал исследование с нейтрофилов в течение последних десятилетий. Таким образом, использование воспроизводимых анализов для выделения нейтрофилов должно облегчить дальнейшее исследование нейтрофилов-опосредованного immunoloческие функции бывших естественных условиях и в естественных условиях. На сегодняшний день несколько методов были описаны для выделения нейтрофилов, такие как центрифугирование в градиенте плотности крови человека и мыши крови или костного мозга 8,9, положительный или отрицательный иммуномагнитного обогащение нейтрофилов из крови мыши или костного мозга 10,11, и сбор нейтрофилов из брюшной полости мышей после внутрибрюшинной инъекции тиогликолята или других противовоспалительных агентов 12. Хотя нейтрофилов может быть легко выделено в больших количествах из крови человека, этот метод является оптимальным у мышей из-за ограниченного объема крови мышей, что исключает выделение достаточного нейтрофилов для функциональных исследований или приемные экспериментов передачи 13. Кроме того, хотя выход тиогликолята-вызывали клетки из брюшной полости больше по сравнению с крови мышей, чистота нейтрофилов в воспалительном перитонеального лаважа изменяется между60-90%, а изолированный нейтрофилы проявляют активированный фенотип. Таким образом, клетки собирали с использованием этого метода может быть использован только для выполнения функциональных исследований активированных но не стимулированных нейтрофилов, как мышь брюшную полость имеет несколько нейтрофилов в стационарном состоянии 12. Вместо этого, костный мозг является удобным резервуар для сбора большого количества или стимулированных или активированный 11,14 нейтрофилы, которые затем могут быть использованы для последующих функциональных исследований, таких как фагоцитоз, убийства и дегрануляции или для приемных передачи в получатель мышей.
Здесь мы описываем простой и быстрый (~ 2 ч) протокол, который обеспечивает высокий выход (~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов / неинфицированных мышей, или до 30-40 × 10 6 нейтрофилов / инфицированные мыши) чистого (80 -95%) нейтрофилов> 95% жизнеспособность из костного мозга. Этот метод использует коммерчески доступные Histopaque, которые в градиенте плотности ячейки отдельнорацион сред, состоящих из Ficoll и натрий диатризоат, отделить нейтрофилов из костного мозга мышей. Этот метод дает значительно большее количество нейтрофилов на мышь по сравнению с полостью крови или перитонеального, он может быть использован для сбора нейтрофилов у мышей и в стационарном состоянии или после инфекции и легче слое по сравнению с центрифугирование в градиенте плотности метод, который использует прерывистый перколлом градиенты, состоящий из 55% / 65% / 75% Percoll в PBS 9. Кроме того, время и ресурсы, необходимые для сбора чистой нейтрофилов значительно снизился по сравнению с выделения нейтрофилов с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток. Кроме того, поскольку этот способ не включать иммуномагнитного шаг обогащения, это более экономически эффективным, и это позволяет избежать воздействия на клетки магнитного колонку и антитела, таким образом уменьшая вероятность активации нейтрофилов.
В дополнение к выполнению функциональных исследований изолированной neutrophшек исключая виво и приемных передачи клеток в мышей-реципиентов, этот протокол также описывает способ маркировки изолированных нейтрофилов с использованием различных красителей CellTracker. Дифференциальный маркировки нейтрофилов у мышей различных генетических фоны могут быть адаптированы в конкурентных исследований репопуляцию для отслеживания переданных нейтрофилов в тканях мышей-реципиентов с использованием проточной цитометрии, которые могут обеспечить механистической представление о непосредственной роли определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в целевые воспаленных органов 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим надежный, простой, быстрый и экономичный протокол для выделения большого количества нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой чистотой и выживаемость с помощью центрифугирования в градиенте плотности подхода. Когда этот протокол выполняется правильно, ~ 6-12 × 10 <su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана отделом очной исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национального института здоровья (NIH), США.
Все Мышей содержали в американской ассоциации по аккредитации лабораторий Animal Care аккредитованных вивария при Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных под эгидой протоколом, утвержденным уходу и использованию животных комитета NIAID.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
