Summary

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

Vi beskriver ett protokoll för isolering och rening av neutrofiler från musbenmärg genom densitetsgradientcentrifugering och för neutrofil märkning med hjälp CellTracker färgämnen. Detta representerar en enkel, snabb, reproducerbar och ekonomisk metod för att erhålla ett stort antal neutrofiler för efterföljande funktionella studier eller adoptiv överföring och spårning experiment.

Abstract

Neutrofiler är viktiga effektorceller i det medfödda immunförsvaret. De är snabbt rekryteras vid ställen för akut inflammation och utöva skyddande eller patogena effekter beroende på inflammatorisk miljö. Ändå, trots den oumbärliga roll neutrofiler i immunitet, detaljerad förståelse av de molekylära faktorer som medlar neutrofiler "effektor och immunopathogenic effekter i olika infektionssjukdomar och inflammatoriska tillstånd fortfarande saknas, delvis på grund av sin korta halveringstid, svårigheterna med hanteringen av dessa celler och bristen på tillförlitliga experimentella protokoll för att erhålla tillräckligt antal neutrofiler för nedströms funktionella studier och adoptivföräldrar experiment överföring. Därför, enkelt, snabbt, ekonomiskt och tillförlitligt sätt är mycket önskvärt för att skörda tillräckligt många mus neutrofiler för bedömning funktioner såsom fagocytos, dödande, cytokin produktion, degranulering och människohandel. I detta syftepresenterar vi en reproducerbar densitetsgradientcentrifugering-baserat protokoll, som kan anpassas på alla laboratorier för att isolera ett stort antal neutrofiler från benmärgen av möss med hög renhet och livsduglighet. Dessutom presenterar vi ett enkelt protokoll som använder CellTracker färgämnen för att märka de isolerade neutrofiler, som sedan kan adoptivt överföras till mottagande möss och spåras i flera vävnader i minst 4 h efter överföring med användning av flödescytometri. Användning av detta tillvägagångssätt kan differentiell märkning av neutrofiler från vildtyp och gen-brist möss med olika CellTracker färgämnen med framgång användas för att utföra konkurrenskraftiga inplantering studier för utvärdering av den direkta rollen av specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet till målvävnader in vivo .

Introduction

Neutrofiler är de mest förekommande leukocyter hos människor. De är den främsta cellulära del av det medfödda immunförsvaret och fungera som en första försvarslinje mot invaderande mikroorganismer. Patienter med förvärvad neutropeni och primär immunbrist som påverkar neutrofila siffror och / eller funktion utveckla livshotande invasiva bakterie-och svampinfektioner, och betona vikten av dessa celler i värdförsvar 1. Immun erkännande av invaderande patogener på infektion webbplatsen genom deras besläktade mönsterigenkänning receptorer resulterar i induktion av en iscensatt medfödda immunförsvaret, vilket leder till utsöndring av kemoattraktanter som genererar en chemotactic gradient kan rekrytera neutrofiler från blodet in i den inflammerade vävnaden 2 . Efter neutrofiler in infektionen webbplats, de blir aktiverade, vilket leder till cytokin och kemokinproduktion, patogen upptag, och dödande via oxidativ och icke-oxidativ migchanisms 3. Förutom deras erkänd roll i det medfödda immunförsvaret, har neutrofiler också nyligen visats spela viktiga roller som initiativtagare effektiva adaptiva immunsvar 4. Å andra sidan, bortsett från deras skyddande roller i immunitet, kan neutrofiler medierar även vävnadsskada och immunopatologi grund av överdriven ackumulation och / eller aktivering vid ställen för inflammation, såsom visas i ett antal infektiösa och autoimmuna sjukdomar 5-7.

Trots den oumbärliga roll neutrofiler vid montering effektiva medfödda immunförsvaret och deras pleiotropa effektorfunktionerna i flera infektionssjukdomar och inflammatoriska tillstånd, tekniska svårigheter med att hantera dessa celler och brist på tillförlitliga experimentella protokoll har hindrat forskning med neutrofiler under de senaste decennierna. Därför bör användning av reproducerbara analyser för isolering av neutrofiler främja ytterligare forskning om neutrofilmedierad immunologiska funktioner ex vivo och in vivo. Hittills har flera metoder beskrivits för isolering av neutrofiler, såsom densitetsgradientcentrifugering av humanblod och mus blod eller benmärg 8,9, positiv eller negativ immunomagnetisk anrikning av neutrofila granulocyter från musblod eller benmärg 10,11, och skörd av neutrofiler från peritonealhålan hos möss efter intraperitoneal injektion av tioglykolat eller andra inflammatoriska medel 12. Även neutrofiler kan lätt isoleras i stora antal från humant blod, är denna metod suboptimal i möss på grund av den begränsade volymen musblod som utesluter isolering av tillräckliga neutrofiler för funktionella studier eller adoptiv experiment överföra 13. Även om utbytet av tioglykollat-framkallade celler från peritonealhålan är större jämfört med den för musblod, varierar renheten av neutrofiler i den inflammatoriska peritonealsköljning mellan60-90%, och de isolerade neutrofiler uppvisar en aktiverad fenotyp. Sålunda insamlade cellerna med den här metoden endast kan användas för att utföra funktionella studier av aktiverade men inte av ostimulerade neutrofiler, som musen bukhålan har några neutrofiler vid steady state 12. Istället är benmärgen ett bekvämt reservoar för att skörda ett stort antal antingen ostimulerade eller aktiverade neutrofiler 11,14, som sedan kan användas för nedströms funktionella studier såsom fagocytos, dödande och degranulering, eller för adoptiv överföring till mottagande möss.

Häri beskriver vi en enkel och snabb (~ 2 tim) protokoll, vilket ger en hög direktavkastning (~ 6-12 × 10 6 neutrofiler / infekterade mus, eller upp till 30-40 × 10 6 neutrofiler / infekterad mus) ren (80 -95%) neutrofiler med> 95% viabilitet från benmärgen. Denna metod använder kommersiellt tillgänglig Histopaque, vilket är densitetsgradient cell separatranson massmedia som består av Ficoll och natriumdiatrizoat, att separera neutrofiler från benmärgen hos möss. Denna metod ger betydligt större antal neutrofiler per mus jämfört med blod eller peritonealhålan, kan den användas för att samla in neutrofiler från möss både vid steady state eller efter infektion, och det är lättare att skiktet jämfört med densitetsgradientcentrifugering metod som använder diskontinuerlig Percoll gradienter som består av 55% / 65% / 75% Percoll i PBS 9. Dessutom är den tid och de resurser som krävs för att samla in rena neutrofiler minskat avsevärt jämfört med neutrofila isolering användning av fluorescens-cellsortering. Dessutom, eftersom denna metod inte involverar en immunomagnetisk anrikningssteg, är det mer kostnadseffektivt, och den undviker exponering av celler för den magnetiska kolonnen och antikroppar, vilket sålunda minskar sannolikheten för neutrofil aktivering.

Förutom att utföra funktionella studier av isolerat neutrophils ex vivo och adoptiv överföring av celler in i mottagarmöss, beskriver detta protokoll också ett förfarande för märkning av isolerade neutrofiler som använder olika CellTracker färgämnen. Differential märkning av neutrofiler från möss med olika genetiska bakgrunder kan anpassas på konkurrensutsatta inplantering studier för att spåra de överförda neutrofiler i vävnader hos mottagaren möss med användning av flödescytometri, vilket kan ge mekanistisk insikt om direkta roll specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet i mål inflammerade organ 6.

Protocol

Ett. Isolering av benmärg hos möss Cells Euthanize möss med institutionens djurvård kommitté-godkända protokoll och spraya djurets yta med 70% etanol. Gör ett snitt i huden i mitten av buken och ta bort huden från bortre delen av musen inklusive huden som täcker de nedre extremiteterna. Skär av muskler från de nedre extremiteterna med en sax och försiktigt förskjuta acetabulum från höftleden, samtidigt som man undviker att bryta lårbenet huvudet. Ta bort de kvarva…

Representative Results

Detta protokoll är optimerad för skörd av benmärgsceller från möss och den efterföljande separationen av neutrofiler från dessa celler genom densitetsgradientcentrifugering med användning av kommersiellt tillgängliga medier Histopaque cellseparation. Neutrofiler isolerades med användning av denna metod kan användas för en mängd olika nedströms funktionella studier ex vivo och för adoptiv överföring experiment i mottagaren möss. Den typiska utbytet av insamling av …

Discussion

Häri presenterar vi en pålitlig, enkel, snabb och ekonomisk protokoll för isolering av ett stort antal neutrofiler från benmärgen av möss med hög renhet och viabilitet med användning av en densitet tillvägagångssätt gradientcentrifugering. När detta protokoll utförs korrekt, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofiler utvinnas från en icke-infekterade mus och så många som ~ 30-40 × 10 6 neutrofiler kan isoleras från en mus efter infektion 6. De isolerade neutrofiler är 80-95% ren o…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Avdelningen för Interna Forskning av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA.

Samtliga möss hölls vid en American Association för ackreditering av laboratoriet Animal Care-ackrediterad djuranläggningen vid National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) och förvaras i enlighet med de förfaranden som beskrivs i Guide för skötsel och användning av försöksdjur under överinseende av ett protokoll som godkändes av Animal Care och användning kommittén av NIAID.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
      Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES Cellgro 10-041-CV  
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) GemCell 100500  
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140  
0.5 M EDTA Quality Biological Inc 351-027-101  
0.2% and 1.6% sodium chloride JT Baker 3624 Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771 Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV  
Ethyl Alcohol (200 proof) The Warner Graham Company 64-17-5  
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) Invitrogen C-7025 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) Invitrogen C-2927 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) eBioscience 170451-82  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551461  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 560599  
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) eBioscience 47-0112-82  
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141 Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Molecular Probes L-23105 Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma 67-68-5  
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS USB Corporation 19943  
      Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
      Materials
C57BL/6 mice Taconic    
15 ml centrifuge tubes Corning 430053  
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070  
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B  
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B  
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B  
Pasteur pipettes (3 ml) BD Falcon 357575  
12 ml syringes Kendall monoject 512878  
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122  
100 mm cell strainers BD Falcon 352360  
Bactericidal Petri dishes BD Falcon 351029  
Combitips Plus Biopur Eppendorf 2249608-5  
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) Biomedical Research Instruments 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 Instruments sterilized prior to use
      Equipment
Tissue culture hood The Baker Company SG403  
Refrigerated centrifuge Thermo Fischer Scientific 75004521  
37 °C shaking water bath Thermo Fischer Scientific 3166721  
      Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.

References

  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
  4. Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
  5. Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  6. Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  7. Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
  8. Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  9. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  10. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  11. Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  12. Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
  13. Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
  14. Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
  15. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
  16. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  18. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  19. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
  20. Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
  21. Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
  22. Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
  23. Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
check_url/fr/50586?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J. Vis. Exp. (77), e50586, doi:10.3791/50586 (2013).

View Video