Vi beskriver ett protokoll för isolering och rening av neutrofiler från musbenmärg genom densitetsgradientcentrifugering och för neutrofil märkning med hjälp CellTracker färgämnen. Detta representerar en enkel, snabb, reproducerbar och ekonomisk metod för att erhålla ett stort antal neutrofiler för efterföljande funktionella studier eller adoptiv överföring och spårning experiment.
Neutrofiler är viktiga effektorceller i det medfödda immunförsvaret. De är snabbt rekryteras vid ställen för akut inflammation och utöva skyddande eller patogena effekter beroende på inflammatorisk miljö. Ändå, trots den oumbärliga roll neutrofiler i immunitet, detaljerad förståelse av de molekylära faktorer som medlar neutrofiler "effektor och immunopathogenic effekter i olika infektionssjukdomar och inflammatoriska tillstånd fortfarande saknas, delvis på grund av sin korta halveringstid, svårigheterna med hanteringen av dessa celler och bristen på tillförlitliga experimentella protokoll för att erhålla tillräckligt antal neutrofiler för nedströms funktionella studier och adoptivföräldrar experiment överföring. Därför, enkelt, snabbt, ekonomiskt och tillförlitligt sätt är mycket önskvärt för att skörda tillräckligt många mus neutrofiler för bedömning funktioner såsom fagocytos, dödande, cytokin produktion, degranulering och människohandel. I detta syftepresenterar vi en reproducerbar densitetsgradientcentrifugering-baserat protokoll, som kan anpassas på alla laboratorier för att isolera ett stort antal neutrofiler från benmärgen av möss med hög renhet och livsduglighet. Dessutom presenterar vi ett enkelt protokoll som använder CellTracker färgämnen för att märka de isolerade neutrofiler, som sedan kan adoptivt överföras till mottagande möss och spåras i flera vävnader i minst 4 h efter överföring med användning av flödescytometri. Användning av detta tillvägagångssätt kan differentiell märkning av neutrofiler från vildtyp och gen-brist möss med olika CellTracker färgämnen med framgång användas för att utföra konkurrenskraftiga inplantering studier för utvärdering av den direkta rollen av specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet till målvävnader in vivo .
Neutrofiler är de mest förekommande leukocyter hos människor. De är den främsta cellulära del av det medfödda immunförsvaret och fungera som en första försvarslinje mot invaderande mikroorganismer. Patienter med förvärvad neutropeni och primär immunbrist som påverkar neutrofila siffror och / eller funktion utveckla livshotande invasiva bakterie-och svampinfektioner, och betona vikten av dessa celler i värdförsvar 1. Immun erkännande av invaderande patogener på infektion webbplatsen genom deras besläktade mönsterigenkänning receptorer resulterar i induktion av en iscensatt medfödda immunförsvaret, vilket leder till utsöndring av kemoattraktanter som genererar en chemotactic gradient kan rekrytera neutrofiler från blodet in i den inflammerade vävnaden 2 . Efter neutrofiler in infektionen webbplats, de blir aktiverade, vilket leder till cytokin och kemokinproduktion, patogen upptag, och dödande via oxidativ och icke-oxidativ migchanisms 3. Förutom deras erkänd roll i det medfödda immunförsvaret, har neutrofiler också nyligen visats spela viktiga roller som initiativtagare effektiva adaptiva immunsvar 4. Å andra sidan, bortsett från deras skyddande roller i immunitet, kan neutrofiler medierar även vävnadsskada och immunopatologi grund av överdriven ackumulation och / eller aktivering vid ställen för inflammation, såsom visas i ett antal infektiösa och autoimmuna sjukdomar 5-7.
Trots den oumbärliga roll neutrofiler vid montering effektiva medfödda immunförsvaret och deras pleiotropa effektorfunktionerna i flera infektionssjukdomar och inflammatoriska tillstånd, tekniska svårigheter med att hantera dessa celler och brist på tillförlitliga experimentella protokoll har hindrat forskning med neutrofiler under de senaste decennierna. Därför bör användning av reproducerbara analyser för isolering av neutrofiler främja ytterligare forskning om neutrofilmedierad immunologiska funktioner ex vivo och in vivo. Hittills har flera metoder beskrivits för isolering av neutrofiler, såsom densitetsgradientcentrifugering av humanblod och mus blod eller benmärg 8,9, positiv eller negativ immunomagnetisk anrikning av neutrofila granulocyter från musblod eller benmärg 10,11, och skörd av neutrofiler från peritonealhålan hos möss efter intraperitoneal injektion av tioglykolat eller andra inflammatoriska medel 12. Även neutrofiler kan lätt isoleras i stora antal från humant blod, är denna metod suboptimal i möss på grund av den begränsade volymen musblod som utesluter isolering av tillräckliga neutrofiler för funktionella studier eller adoptiv experiment överföra 13. Även om utbytet av tioglykollat-framkallade celler från peritonealhålan är större jämfört med den för musblod, varierar renheten av neutrofiler i den inflammatoriska peritonealsköljning mellan60-90%, och de isolerade neutrofiler uppvisar en aktiverad fenotyp. Sålunda insamlade cellerna med den här metoden endast kan användas för att utföra funktionella studier av aktiverade men inte av ostimulerade neutrofiler, som musen bukhålan har några neutrofiler vid steady state 12. Istället är benmärgen ett bekvämt reservoar för att skörda ett stort antal antingen ostimulerade eller aktiverade neutrofiler 11,14, som sedan kan användas för nedströms funktionella studier såsom fagocytos, dödande och degranulering, eller för adoptiv överföring till mottagande möss.
Häri beskriver vi en enkel och snabb (~ 2 tim) protokoll, vilket ger en hög direktavkastning (~ 6-12 × 10 6 neutrofiler / infekterade mus, eller upp till 30-40 × 10 6 neutrofiler / infekterad mus) ren (80 -95%) neutrofiler med> 95% viabilitet från benmärgen. Denna metod använder kommersiellt tillgänglig Histopaque, vilket är densitetsgradient cell separatranson massmedia som består av Ficoll och natriumdiatrizoat, att separera neutrofiler från benmärgen hos möss. Denna metod ger betydligt större antal neutrofiler per mus jämfört med blod eller peritonealhålan, kan den användas för att samla in neutrofiler från möss både vid steady state eller efter infektion, och det är lättare att skiktet jämfört med densitetsgradientcentrifugering metod som använder diskontinuerlig Percoll gradienter som består av 55% / 65% / 75% Percoll i PBS 9. Dessutom är den tid och de resurser som krävs för att samla in rena neutrofiler minskat avsevärt jämfört med neutrofila isolering användning av fluorescens-cellsortering. Dessutom, eftersom denna metod inte involverar en immunomagnetisk anrikningssteg, är det mer kostnadseffektivt, och den undviker exponering av celler för den magnetiska kolonnen och antikroppar, vilket sålunda minskar sannolikheten för neutrofil aktivering.
Förutom att utföra funktionella studier av isolerat neutrophils ex vivo och adoptiv överföring av celler in i mottagarmöss, beskriver detta protokoll också ett förfarande för märkning av isolerade neutrofiler som använder olika CellTracker färgämnen. Differential märkning av neutrofiler från möss med olika genetiska bakgrunder kan anpassas på konkurrensutsatta inplantering studier för att spåra de överförda neutrofiler i vävnader hos mottagaren möss med användning av flödescytometri, vilket kan ge mekanistisk insikt om direkta roll specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet i mål inflammerade organ 6.
Häri presenterar vi en pålitlig, enkel, snabb och ekonomisk protokoll för isolering av ett stort antal neutrofiler från benmärgen av möss med hög renhet och viabilitet med användning av en densitet tillvägagångssätt gradientcentrifugering. När detta protokoll utförs korrekt, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofiler utvinnas från en icke-infekterade mus och så många som ~ 30-40 × 10 6 neutrofiler kan isoleras från en mus efter infektion 6. De isolerade neutrofiler är 80-95% ren o…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Avdelningen för Interna Forskning av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA.
Samtliga möss hölls vid en American Association för ackreditering av laboratoriet Animal Care-ackrediterad djuranläggningen vid National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) och förvaras i enlighet med de förfaranden som beskrivs i Guide för skötsel och användning av försöksdjur under överinseende av ett protokoll som godkändes av Animal Care och användning kommittén av NIAID.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
Materials | |||
C57BL/6 mice | Taconic | ||
15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
Equipment | |||
Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |