İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi
Summary
Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.
Abstract
Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli efektör hücrelerdir. Bunlar hızla akut inflamasyon bölgelerinde işe ve inflamatuar ortamı bağlı olarak koruyucu veya patojenik etkiler gösterebilir vardır. Bununla birlikte, farklı bulaşıcı hastalıklar ve inflamatuar koşullarda nötrofil 'efektör ve immunopathogenic etkileri aracılık moleküler faktörlerin bağışıklık, ayrıntılı bir anlayış nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen hala kısmen, kısa yarı ömrü, bunların kullanımı ile zorluklar, eksik hücreleri ve alt fonksiyonel çalışmalar ve evlat edinen transferi deneyler için nötrofil yeterli sayıda elde etmek için güvenilir deneysel protokollerin eksikliği. Bu nedenle, basit, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir yöntem gibi fagositoz, öldürme, sitokin üretimi, degranülasyonunun ve ticareti gibi işlevleri değerlendirmek için fare nötrofil yeterli sayıda hasat için son derece arzu edilir. Bu amaçla,yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izole etmek için, herhangi bir laboratuvar olarak adapte edilebilir, tekrarlanabilir yoğunluk gradyan santrifüj tabanlı bir protokol, mevcut. Ayrıca, daha sonra adoptively akım sitometri kullanarak en az 4 saat sonrası transferi için alıcı farelere transfer ve çeşitli dokularda izlenebilir izole nötrofil, etiketlemek için CellTracker boyalar kullanan basit bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı CellTracker boyalarla yabani tip ve gen-eksik fareler nötrofil diferansiyel etiketleme başarılı bir şekilde in vivo olarak hedef dokulara kan nötrofilleri ticareti özel genlerin doğrudan rolünün değerlendirilmesi için rekabet repopulation çalışmaların gerçekleştirilmesi için kullanılabilecektir .
Introduction
Nötrofiller, insanlarda en bol lökositlerdir. Onlar mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve hareket temel hücresel bileşenidir. Nötrofil sayısı ve / veya fonksiyonunu etkileyen kazanılmış nötropeni ve primer immün yetmezlikler olan hastalar konak savunma 1 bu hücrelerin önemini vurgulayarak hayatı tehdit eden invazif bakteriyel ve mantar enfeksiyonları, geliştirmek. Iltihaplı doku 2 içine kan dolaşımından işe nötrofil yeteneğine sahip bir kemotaktik degrade oluşturmak chemoattractants salgılanmasına yol açan bir yönetilen doğal immün yanıt, en indüksiyon kendi soydaş desen tanıma reseptörleri sonuçları enfeksiyon yerinde patojenlerin işgalci bağışıklık tanınması . Nötrofiller enfeksiyon sitesine girmek sonra, aktif hale, hangi sitokin ve kemokin üretimi, patojen alımı yol açar ve oksidatif ve non-oksidatif beni ile öldürüyorchanisms 3. Doğuştan gelen bağışıklık onların iyi bilinen rolü yanı sıra, nötrofil yakın zamanda etkili adaptif immün yanıtları 4 başlatanlar gibi önemli rol oynar gösterilmiştir. 5-7 bulaşıcı ve öz bağışıklık hastalıklarının çeşitli 'de gösterildiği gibi, diğer yandan, ayrı bağışıklık kendi koruyucu rolleri, nötrofiller, aynı zamanda, aşırı birikimi ve / veya inflamasyon bölgelerinde aktivasyonuna bağlı doku hasarı ve İmmünopatoloji aracılık edebilir.
Montaj etkili doğal immün yanıtları ve çeşitli enfeksiyon hastalıkları ve inflamatuar durumlar, güvenilir deneysel protokollerin bu hücrelerin ve eksikliği taşıma ile teknik zorluklar içinde pleiotropik efektör fonksiyonları nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen geçmiş yıllarda nötrofil, araştırma engellemiştir. Bu nedenle, nötrofillerin izolasyonu için tekrarlanabilir analizlerin kullanımı ve nötrofil aracılı immunolo için daha fazla araştırma kolaylaştırmalıdırjik fonksiyonları, ex vivo ve in vivo. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler, örneğin insan kanı, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ve fare kan veya kemik iliği 8,9, fare kan veya kemik iliği 10,11 nötrofillerin pozitif veya negatif zenginleştirme immünomanyetik olarak nötrofillerin izolasyonu için anlatıldığı ve hasat edilmiştir tiyoglikolat veya diğer enflamatuar ajanların 12 intraperitoneal enjeksiyonu takiben farelerin periton boşluğundan nötrofillerin. Nötrofiller insan kanından kolayca çok sayıda izole edilebilir, ancak bu yöntem, işlevsel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri 13 için yeterli nötrofil izole edilmesini önleyen fare kan sınırlı bir hacme bağlı olarak farelerde suboptimaldir. Verimi tiyoglikolat-ortaya çıkardı, ancak ek olarak, periton boşluğundan kan hücrelerinin fare ile karşılaştırıldığında daha büyüktür, inflamatuar peritoneal lavaj nötrofillerin saflık arasında değişir% 60-90, ve izole edilen nötrofillerin aktive edilmiş bir fenotip sergiler. Bu yüzden, hücreler, fare peritoneal boşluğuna kararlı durum 12 az sayıda nötrofil olduğu gibi bu yöntem sadece, aktif fonksiyonel çalışmalar yapmak için kullanılmaz, ancak uyarılmamış nötrofil edilebilir kullanılarak toplandı. Bunun yerine, kemik iliği ve daha sonra, fagositoz, öldürme ve degranülasyonu veya alıcı farelere adoptif transfer gibi akım aşağı fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir ya da uyarılmamış ve aktifleştirilmiş nötrofillerin 11,14, çok sayıda hasat edilmesi için uygun bir haznedir.
Bu yazıda, yüksek verim sağlayan basit ve hızlı (~ 2 saat) protokolü, tarif (~ 6-12 × 10 6 nötrofil / bulaşmamış fare veya 30-40 × 10 6 nötrofil / enfekte fare) saf (80 -95%) kemik iliğinden>% 95 canlılığı ile nötrofil. Bu yöntem, yoğunluk gradyanlı hücre ayrı olarak ticari olarak temin edilebilen Histopaque kullanırFicoll ve sodyum diatrizoate oluşan oranı ortam, farelerin kemik iliğinden nötrofil ayırmak için. Bu yöntem, kan ya da periton boşluğu ile karşılaştırıldığında fare başına nötrofil önemli ölçüde daha fazla sayıda verir, bu kararlı durum ya da enfeksiyon sonrası her iki farenin nötrofillerin toplamak için kullanılan ve süreksiz kullanan yoğunluk gradyan santrifüj yönteme göre tabakası daha kolay olabilir % 55 /% 65 / PBS içinde 75% 9 Percoll oluşan Percoll gradient. Buna ek olarak, zaman ve saf nötrofil toplamak için gerekli kaynakları önemli ölçüde Floresan-Aktif Hücre Ayırma kullanarak nötrofil izolasyon göre azalmıştır. Ayrıca, bu yöntem, bir immünomanyetik zenginleştirme aşamasında anlamına gelmez, çünkü daha düşük maliyetli olan ve bu nedenle nötrofil aktivasyonunun olasılığını azaltarak, manyetik kolonu ve antikorlar hücrelerinin maruz kalma önler.
Izole neutroph fonksiyonel çalışmalar performans ek olarakils ex vivo ve alıcı farelere hücrelerinin adoptif transfer, bu protokol, aynı zamanda farklı CellTracker boyalar kullanılarak izole nötrofil etiketlenmesi için bir yöntem açıklanır. Çeşitli genetik kökenden farelerden alınan nötrofil Diferansiyel etiketleme kandan nötrofil ticareti belirli genlerin doğrudan rol mekanik fikir sağlayabilir akım sitometri kullanarak alıcı farelerin dokularında transfer nötrofil izlemek için rekabetçi repopulation çalışmalarda adapte edilebilir hedef iltihaplı organları 6 içine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu olgu, bir yoğunluk gradyan santrifüj yaklaşım kullanılarak yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izolasyonu için güvenilir, basit, hızlı ve ekonomik bir protokol mevcut. Bu protokol doğru gerçekleştirildiğinde, ~ 6-12 x 10 6 nötrofil enfekte olmamış bir fareden elde edilebilir ve en çok ~ olarak 30-40 x 10 6 nötrofil enfeksiyonu 6 sonra bir fareden izole edilebilir. Izole nötrofil% 80-95 saf ve>% 95 yaşayabilir. </p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID), Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), ABD İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir.
Tüm fareler Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID) de Laboratuar Hayvan Bakımı-akredite hayvan tesisin Akreditasyon için Amerikan Derneği muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen usullere uygun olarak muhafaza edildi NIAID ve Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol himayesinde.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
