अभिलेखीय formalin तय की और (FFPE) एम्बेडेड आयल नैदानिक नमूनों की बीमारियों की जांच के लिए मूल्यवान सामग्री हैं. यहाँ हम microdissected FFPE ऊतक की गहराई प्रोटिओमिक विश्लेषण की अनुमति एक नमूना तैयार कार्यप्रवाह प्रदर्शित करता है.
संरक्षित नैदानिक सामग्री मानव विकारों का प्रोटिओमिक जांच के लिए एक अनूठा स्रोत है. यहाँ हम formalin के बड़े पैमाने पर मात्रात्मक विश्लेषण तय की और आयल एम्बेडेड (FFPE) ऊतक की अनुमति एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रक्रिया चार अलग चरणों शामिल हैं. पहले एक FFPE सामग्री और ब्याज की कोशिकाओं की microdissection से वर्गों की तैयारी है. दूसरे चरण में अलग कक्षों lysed और 'फिल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयार' (FASP) तकनीक का उपयोग कर कार्रवाई की जाती है. इस चरण में, प्रोटीन नमूना सेल के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों से समाप्त हो रहे हैं और endoproteinase lysC और trypsin का उपयोग दो चरणों में पच जाता है.
प्रत्येक पाचन के बाद, पेप्टाइड्स अलग भागों में एकत्र कर रहे हैं और उनकी सामग्री एक बेहद संवेदनशील प्रतिदीप्ति माप का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. अंत में, पेप्टाइड्स 'पिपेट की नोक' microcolumns पर fractionated रहे हैं. LysC पेप्टाइड्स जबकि 4 भागों में अलग हो रहे हैं tryptic पीईptides 2 भागों में विभाजित हैं. इस तरह से तैयार नमूने 10,000 प्रोटीन की गहराई तक सामग्री की मात्रा मिनट से proteomes के विश्लेषण की अनुमति. इस प्रकार, वर्णित कार्यप्रवाह संभावित बायोमार्कर और दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए और साथ ही एक प्रणाली में व्यापक फैशन में बीमारियों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है.
Paraformaldehyde के साथ फिक्सिंग और आयल (FFPE) में embedding संरक्षण और नैदानिक ऊतक सामग्री की pathomorphologic जांच के लिए मानक पद्धति है. संरक्षित ऊतक के माइक्रोस्कोपी रोग से संबंधित morphological परिवर्तन की पहचान, और रोग से संबंधित एंटीजन की घटना का पता लगाने और स्कोरिंग की अनुमति देता है. FFPE नमूने के आम तौर पर केवल एक छोटा सा हिस्सा इन विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाता है, नैदानिक सामग्री की बड़ी मात्रा में संग्रहीत रहते हैं और पढ़ाई के अन्य प्रकारों में शोषण किया जा सकता है.
हाल के एक दशक के दौरान जीवन विज्ञान में अनुसंधान शक्तिशाली प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी से मजबूत हुआ है. इस प्रौद्योगिकी की अनुमति देता है जटिल प्रोटीन मिश्रण में प्रोटीन के हजारों की पहचान और quantitation. प्रौद्योगिकी की एक महत्वपूर्ण विशेषता बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए सामग्री का केवल मिनट मात्रा की जरूरत है कि है. हाल के प्रोटिओमिक पढ़ाई प्रोटीन लगभग COMP के पैमाने पर अध्ययन किया जा सकता है कि प्रदर्शनlete 1, 2 proteomes. जांच की इस प्रकार की कोशिकाओं की संरचना और रोगों में विषम के स्तर पर होने वाली प्रोटीन के समूहों की पहचान करने में प्रणाली विस्तृत अंतर्दृष्टि सक्षम बनाता है. इन अध्ययनों बड़े बड़े पैमाने पर spectrometric क्षमताओं की आवश्यकता है, जबकि हाल ही में काम पहचान के समान हद माप 3 के एक ही दिन के भीतर प्राप्त किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है.
अपेक्षाकृत कम नमूना राशि की आवश्यकता है और संरक्षित नैदानिक नमूनों की व्यापक उपलब्धता FFPE सामग्री की प्रोटिओमिक अन्वेषण (एक समीक्षा 4 देखने के लिए) को सक्षम करने के तरीकों को विकसित करने के लिए हमें और दूसरों के लिए परीक्षा. हम तय ऊतक 5 से प्रोटीन की मात्रात्मक निकासी की अनुमति एक प्रोटोकॉल विकसित किया है एक गर्मी उपचार के तहत नि: संक्रामक निर्धारण के उलटने का लाभ उठाते हुए. हम निर्धारण प्रक्रिया प्रोटीन, लेकिन यह भी कम से कम कुछ posttranslational संशोधनों को न केवल बरकरार रखता है कि पता चला है. Phosphorylation और एन ग्लाइकोसिलेशन हालांकि FFPE नमूने 5, यह एक अच्छी तरह से नियंत्रित ऊतक संग्रह, भंडारण और निर्धारण की स्थिति है के लिए एक शर्त का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. अगला, हम तय ऊतक का एक लेजर कब्जा MICRODISSECTION के लिए और प्रोटिओमिक रिएक्टर आधारित नमूना प्रसंस्करण 6, 7 के लिए विधि अनुकूलित है. कोलोरेक्टल कैंसर पर एक बड़े पैमाने पर अध्ययन नैदानिक सामग्री 8 से microdissected से 7,500 प्रोटीन की मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति दी. अंत में, हम लगातार दो कदम प्रोटीन पाचन प्रोटोकॉल 9 लगाने से microdissected सामग्री के अन्वेषण के रास्ते में सुधार हुआ है. एक एंजाइम का उपयोग आम पाचन रणनीतियों की तुलना में, इस प्रक्रिया को और अधिक अनुक्रम अद्वितीय पेप्टाइड्स की पीढ़ी सक्षम बनाता है और इसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन की पहचान की एक उच्च गहराई में यह परिणाम है. Microdissected मानव colonic ग्रंथ्यर्बुद के विश्लेषण से नमूना 3 प्रति 9,500 प्रोटीन की गहराई तक प्रोटिओमिक विश्लेषण की अनुमति दी. इस संवर्धन मेंहम कम से कम 2 पेप्टाइड्स के साथ 88-89% प्रोटीन की पहचान की अनुमति नमूना प्रति 55,000 पेप्टाइड्स मैप किए वाई. यहाँ हम LC-MS/MS विश्लेषण के लिए FFPE सामग्री से नमूनों की तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस प्रोटोकॉल एक रिएक्टर प्रारूप (FASP) में microdissection के लिए ऊतक स्लाइस की तैयारी, अलग कक्षों की सेल, और नमूना प्रसंस्करण शामिल 6. तो फिर हम पेप्टाइड पैदावार की एक spectrofluorometric दृढ़ संकल्प का वर्णन; इष्टतम पेप्टाइड पहचान के लिए उच्च महत्व के साथ एक कार्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा. अंत में, हम एक मजबूत आयनों एक्सचेंजर (SAX) आधारित पेप्टाइड fractionation के लिए जुदाई तकनीक का प्रदर्शन. इस विधि में पेप्टाइड जुदाई और अंतिम सफाई दोनों पिपेट की नोक microcolumns 10, 11 का उपयोग किया जाता है. यह कदम वैकल्पिक है, लेकिन अधिक माइक्रोग्राम कुछ से पेप्टाइड्स एक भी नमूना से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें अध्ययन में सिफारिश की है. SAX-fractionation काफी अध्यक्ष की संख्या और गतिशील रेंज में वृद्धि कर सकते हैंifications और प्रोटीन अनुक्रम कवरेज 3, 10 हूं.
न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण और माइक्रोएरे तकनीक के साथ तुलनीय गहराई तक प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी द्वारा FFPE सामग्री का अध्ययन करने की क्षमता biomarker और दवा लक्ष्य की खोज में नया दृष्टिकोण को खोलता है. वर्णित प्रोटोकॉल लक्षण वर्णन और 10,000 प्रोटीन के पैमाने पर microdissected कोशिकाओं की आबादी के proteomes के quantitation सक्षम बनाता है. Microdissected सामग्री का कम उपयोग करते समय एक छोटे डेटासेट उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन शायद कई मामलों में उन लोगों को भी मूल्यवान नैदानिक डेटा प्रदान कर सकते हैं. इस प्रकार, नमूनों या तो मेड FASP प्रक्रिया के बाद सीधे विश्लेषण किया जा सकता है या कम भागों में विभाजित किया जा सकता है. FASP प्रक्रिया प्रोटीज के किसी भी प्रकार के साथ संगत है, अन्य एंजाइमों या उनके संयोजन प्रोटीन digestions 6 से इस्तेमाल किया जा सकता है.
FFPE सामग्री की गुणवत्ता विश्लेषण का सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा होना प्रतीत होता है. हम निश्चित ही मूल के ऊतक लेकिन से आ रही है कि अलग अनुभव किया हैईएनटी क्लीनिक विशिष्ट गुण था. एक अन्य क्लिनिक से इसी तरह की सामग्री लगभग बेकार था जबकि, हम उच्च पैदावार पर पेप्टाइड्स उत्पन्न करने में सक्षम थे एक स्रोत से ऊतक का उपयोग करना. इसे लागू निर्धारण और embedding प्रक्रियाओं के साथ ही भंडारण की स्थिति चिकित्सीय सामग्री 12 के गुणों को प्रभावित प्रमुख कारक हैं कि संभावना है. इसलिए यह एक बड़ी परियोजना शुरू करने से पहले कुछ नमूने के गुणों का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है.
कई प्रकाशनों अतीत में FFPE सामग्री के उपयोग की सूचना दी. हालांकि, इन अध्ययनों में पहचान प्रोटीन की संख्या से अधिक 1,000-2,000 प्रोटीन 4 से अधिक नहीं. 10,000 से अधिक प्रोटीन शामिल मानव कोशिका विशिष्ट proteomes के आकार को देखते हुए, इस तरह के अध्ययन लगभग हाउसकीपिंग कार्यों में शामिल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन तक ही सीमित एक बहुत सतही चित्र, प्रदान करने के लिए ही कर रहे थे. हमारे प्रोटोकॉल नैदानिक या जैविक सामग्री एफ के कुशल अलगाव में सक्षम बनाता हैROM ऊतक संरक्षित और सेल, प्रोटीन प्रसंस्करण और पेप्टाइड prefractionation के लिए अनुकूलित है. एक परिणाम के रूप में हमारे नमूना तैयार कार्यप्रवाह, उच्च अंत मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित है, एक लगभग पूरा proteomes में अंतर्दृष्टि देता है. उल्लेखनीय है, इस मिनट नमूना राशि आवश्यकताओं पर संभव है.
संरक्षित ऊतकों का उपयोग करने का प्रमुख लाभ उनके रिश्तेदार व्यापक उपलब्धता है. FFPE नमूने कई वर्षों और दशकों के लिए संग्रहीत है, और कभी कभी बेकार के रूप में माना जाता है, अब, प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी के लिए धन्यवाद, नैदानिक अनुसंधान के लिए के रूप में अत्यधिक मूल्यवान सामग्री दिखाई देते हैं. कई बीमारियों FFPE सामग्री की ताजा या फ्रोजन सामग्री जांच के अध्ययन का उपयोग किया जा सकता है जबकि दुर्लभ बीमारियों 12 के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होने लगता है, नमूना के एक प्रतिनिधि के सेट आमतौर पर एक लंबा समय लगता है के संग्रह थे.
The authors have nothing to disclose.
लेखक विधि का प्रदर्शन के लिए सतत समर्थन और श्रीमती Katharina Zettl के लिए धन्यवाद डॉ. मथायस मान.
इस काम के लिए एडवांसमेंट ऑफ साइंस मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
Mayer’s hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |