Arkivformalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE) kliniska prover är värdefullt material för undersökning av sjukdomar. Här visar vi en provberedning arbetsflöde tillåter djupgående proteomik analys av microdissected FFPE vävnad.
Konserverad kliniskt material är en unik källa för proteomik utredning av mänskliga sjukdomar. Här beskriver vi ett optimerat protokoll som tillåter storskalig kvantitativ analys av formalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE) vävnad. Förfarandet innefattar fyra distinkta steg. Den första är att förbereda sektioner från FFPE materialet och microdissection av celler av intresse. I det andra steget de isolerade cellerna lyseras och bearbetas med hjälp av "provberedning filter stödd" (FASP) teknik. I detta steg är proteiner utarmat från reagenser som används för provet lys och smälts i två steg med hjälp av endoproteinas LysC och trypsin.
Efter varje spjälkning peptiderna uppsamlades i separata fraktioner och deras innehåll bestäms med användning av en mycket känslig fluorescensmätning. Slutligen är de peptider som fraktioneras på "pipett-tip" mikrokolonner. De LysC-peptider är uppdelade i fyra fraktioner medan tryptiska peptides separeras i två fraktioner. På så sätt framställda prover tillåter analys av proteom från små mängder av materialet till ett djup av 10000-proteiner. Således är den beskrivna arbetsflödet en kraftfull teknik för att studera sjukdomar i ett system-wide-mode och för att identifiera potentiella biomarkörer och läkemedelsmål.
Fäst med paraformaldehyd och inbäddning i paraffin (FFPE) är standardmetoden för konservering och pathomorphologic utredning av klinisk vävnadsmaterial. Mikroskopi av den bevarade vävnaden möjliggör identifiering av sjukdomsrelaterade morfologiska förändringar, samt upptäckt och poängsättning av förekomsten av sjukdomsrelaterade antigener. Eftersom oftast bara en liten del av FFPE provet används i dessa analyser, stora mängder av kliniskt material förblir arkiveras och kan utnyttjas i andra typer av studier.
Under det senaste decenniet har forskningen inom biovetenskap har stärkts genom den kraftfulla proteomik teknik. Denna teknik möjliggör identifiering och kvantifiering av tusentals proteiner i komplexa proteinblandningar. Ett viktigt särdrag hos tekniken är att endast små mängder av material som behövs för storskalig analyser. Nyligen proteomik studier visat att proteiner kan studeras på en skala från nästan complete proteom 1, 2. Denna typ av undersökningar gör systemomfattande insikter i sammansättningen av de celler och identifiering av grupper av proteiner som förekommer på onormala nivåer i sjukdomar. Dessa studier krävs stor kapacitet masspektrometriska, har den senaste tidens arbete visat att kan uppnås liknande grad av identifiering inom en enda dag av mätning 3.
Kravet på en relativt låg provmängd och den breda tillgängligheten av de bevarade kliniska prover frestade oss och andra att utveckla metoder som möjliggör proteomik utforskning av FFPE materialet (för en översikt se 4). Med utnyttjande av reversibilitet formalinfixering under värmebehandling har vi utvecklat ett protokoll som möjliggör kvantitativ extraktion av proteiner från den fasta vävnaden 5. Vi har visat att fixeringen förfarandet bevarar inte bara proteiner, men också åtminstone en del posttranslationella modifieringar. Phosphkan studeras orylation och N-glykosylering hjälp av FFPE proven 5 dock en förutsättning för att det är ett grundligt kontrollerad vävnad insamling, lagring och fixeringsförhållanden. Därefter har vi optimerat metoden för en laser capture microdissection av den fasta vävnaden och för proteomik reaktorbaserade prov behandling 6, 7. En storskalig studie om kolorektal cancer tillåtet kvantitativ analys av 7.500 proteiner från microdissected från kliniskt material 8. Slutligen har vi förbättrat vägen för utforskning av microdissected material genom att tillämpa i rad-två steg proteindigestion protokoll 9. I jämförelse med de gemensamma rötnings strategierna genom enda enzym, möjliggör detta förfarande generation av fler sekvens unika peptider och därmed ger en högre djup av proteinidentifiering. Analys av microdissected mänsklig kolonadenom tillåts proteomik analys till ett djup av 9.500 proteiner per prov 3. I denna study vi kartlagt 55.000 peptider per prov som möjliggör identifiering av 88-89% proteiner med minst 2 peptider. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för beredning av prover från FFPE material för LC-MS/MS analys. Detta protokoll omfattar beredning av vävnadssnitt för microdissection, lys av de isolerade cellerna, och provbehandling i en reaktor-format (FASP) 6. Därefter redovisas en spektrofluorometrisk bestämning av peptidnivåer samt en uppgift med hög prioritet för optimal peptid identifiering av masspektrometri. Slutligen visar vi en stark anjonbytare (SAX) baserad separationsteknik för peptidfraktionering. I denna metod både peptidseparation och slutliga rengöringen utförs med hjälp av pipett-spets mikrokolonner 10, 11. Detta steg är valfritt men rekommenderas i studier där fler än några få mikrogram peptider kan erhållas från ett enda prov. SAX-fraktionering kan avsevärt öka antalet och dynamiskt utbud av identfikationerna och förlänga proteinet sekvenstäckning 3, 10.
Möjligheten att studera FFPE materialet av proteomik teknik till ett djup jämförbar med nukleinsyrasekvensering och microarrayteknik öppnar nya perspektiv i biomarkör och läkemedelsmål upptäckten. Den beskrivna protokollet möjliggör karakterisering och kvantifiering av proteom av populationer av microdissected celler på en skala från 10.000 proteiner. När man använder mindre av microdissected materialet en mindre datamängder kan genereras, men kanske i många fall de kan också ge värdefulla kliniska data. Således kan antingen proverna analyseras direkt efter den MED-FASP förfarandet eller kan separeras i mindre fraktioner. Eftersom FASP förfarande är förenligt med någon typ av proteas, kan andra enzymer eller deras kombination användas från protein digestions 6.
Kvaliteten på FFPE materialet verkar vara den mest kritiska frågan i analysen. Vi har upplevt att det fasta vävnaden av samma ursprung, men kommer från skiljerka kliniker hade distinkta egenskaper. Med hjälp av vävnad från en källa vi kunde generera peptider med hög avkastning, medan liknande material från en annan klinik var nästan värdelösa. Det är troligt att den applicerade fixering och inbäddande förfaranden samt lagringsförhållanden är de viktigaste faktorerna som påverkar egenskaperna för den kliniskt material 12. Därför är det lämpligt att testa egenskaperna hos några prover innan du startar ett större projekt.
Många publikationer rapporterat användningen av FFPE material i det förflutna. Men antalet av proteiner som identifierats i dessa studier aldrig överskridas mer än 1,000-2,000 proteiner 4. Med tanke på storleken på de humana cellspecifika proteom med mer än 10.000 proteiner, sådana studier kunde bara ge en mycket ytlig bild, nästan begränsad till mycket rikliga proteiner involverade i hushållning funktioner. Vår protokoll möjliggör effektiv isolering av kliniska eller biologiska material from bevarade vävnad och är optimerad för lys, proteinbearbetning och peptid prefraktionering. Som en följd av vår provberedning arbetsflöde, då kopplat till den avancerade masspektrometri, låter insikter i en nästan komplett proteom. Noterbart är detta möjligt i minut krav prov belopp.
Den viktigaste fördelen med att använda de bevarade vävnaderna är deras relativa stora tillgänglighet. FFPE prover arkiveras under många år och decennier, och ibland betraktas som värdelösa, nu, tack vare proteomik teknik, verkar som mycket värdefullt material för klinisk forskning. Många sjukdomar kan studeras med hjälp av färsk eller fryst material utredning av FFPE material verkar vara särskilt viktiga för att studera sällsynta sjukdomar 12, var samlingen av ett representativt urval av prov brukar ta lång tid.
The authors have nothing to disclose.
Författaren tackar Dr Matthias Mann för kontinuerligt stöd och fru Katharina Zettl för att demonstrera metoden.
Detta arbete stöddes av Max-Planck-sällskapet för att främja vetenskap.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
Mayer’s hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |