宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用
Summary
ここでは、イメージサイトメトリー、培養中の宿主細胞に対応付けて病原性真菌の定量に使用することができる方法を示す。この技術は、CFU列挙の代替として使用することができる。
Abstract
例えば、 カンジダ·アルビカンス 、 ヒストプラスマカプ 、およびクリプトコッカス·ネオフォルマンスなどの病原性酵母の細胞病原性機構の研究は、一般に、単位分析またはフローサイトメトリーを形成するコロニーを用いて酵母定量化に続いて、哺乳動物宿主又は宿主細胞（ すなわち、マクロファージ）の感染を用いる。コロニー形成単位の列挙は、フィールドで最も一般的に使用される方法であったが、この技術は成長を比較するときに特に懸念される固体培地および低および/または可変メッキ効率、上のいくつかの真菌種のゆっくりとした成長を含めて、不利な点と制限があります野生型および変異株である。フローサイトメトリーは、酵母の生存率に関する迅速な定量的情報を提供することができるが、病原性酵母のフローサイトメトリー検出の適用は、その高コスト及び生物学的安全性の考慮を含む実用的な理由の数が限られている。ここでは、イメージベースのデモンストレーションマクロファージとの共培養中の生存病原性酵母の定量化のためのCellometerビジョン（バイオサイエンスNexcelom、LLC）を使用してフローサイトメトリーの方法論。 2人間の真菌病原体の検出に関する我々の研究の焦点： ヒストプラスマカプとカンジダH.。カプはマクロファージファゴソーム内で複製することによって肺胞マクロファージコロニーを形成し、ここで、我々は定量H.の成長を評価するイメージサイトメトリーと組み合わせて、アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色を用いてRAW 264.7マクロファージにおけるカプ酵母。我々の忠実方法従来のコロニー形成単位の列挙によって測定された反復するの成長傾向が、大幅に増加した感度。さらに、我々は直接Cの GFP発現株でライブマクロファージの感染性を評価アルビカンス 。我々の方法論は、アソシエーションのウィットに重要なヒトの真菌病原体の検出および定量のために、迅速、正確、かつ経済的な手段を提供しています時間宿主細胞。
Introduction
彼らのホストおよび/または宿主細胞に伴う病原性真菌の研究は、多くの場合、時間経過を介して、または別の感染条件下で実行可能な真菌細胞の定量化を必要とする。コロニー形成単位（CFU）の列挙は、生菌数を測定したが、この手法はいくつかの欠点と限界を有することによって標準的な方法である。まず、多くの真菌種は成長が遅いです。固体培地上に見えるコロニーの成長が著しく、研究のペースを遅くする、1〜2週間かかる場合があります。いくつかの希釈がコロニーの可算数を確保するためにメッキしなければならないので、第二に、CFUメッキ中にサンプルの操作は、骨の折れるプロセスです。メッキ効率がよく、100％を下回っているので、第三に、CFU数が蒔い生菌の数よりも一般的に低くなっています。例えば、二形真菌病原体ヒストプラスマカプするめっき効率は90％と高いよいが、日常的な限り低くすることができ30％とは、関連する真菌dimorphのParacoccidioidesのパラゴムノキ 1、2のために（10％）であっても低くなっています。 カンジダ用めっき効率も変動3の対象となります。最後に、固体培地上で成長を確立することができる唯一のライブと活発に分裂する細胞のためのCFU分析アカウントは、多くの状況で、一方、それは死んで、および/または代謝的に不活性な細胞の存在と濃度を決定することは有用であろう。
以前は、いくつかの病原性真菌種の定量化のためのフローサイトメトリーの方法は4-6に記載されている。ただし、共有フローサイトメーター上のバイオセーフティレベル2（BSL2）またはBSL3レベルの病原体の使用に関わるバイオセーフティ封じ込めの問題のために、この手法の採用が限定されている。フローサイトメトリーのように、イメージサイトメトリーは、細胞の定量化の感度かつ迅速な方法である。しかし、画像サイトメトリーを同等の結果7と数分の一のコストで行うことができます–11。ここでは、宿主細胞に伴って病原性真菌のイメージサイトメトリーを実行するための方法が記載されている。我々は2つの人間の真菌病原体を使用して、私たちの方法を実証： ヒストプラスマカプとカンジダをH.。カプは、呼吸器疾患を引き起こす二形真菌病原体であり、ヒトでは、出芽酵母として成長し、肺胞マクロファージ内で複製カンジダは時折カンジダ症の原因となる人間の共生種である。我々は、画像メトリが可視化機能と一緒に、これらの酵母の迅速な定量化を可能にすることを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
イメージサイトメトリーにより、ユーザは高品質の画像をキャプチャし、特殊なソフトウェアを使用して、細胞の迅速な定量化を行うことができる。病原微生物学分野における画像メトリーの適用つの潜在的課題は、カウントされる微生物は、哺乳動物宿主細胞を含む細胞の混合集団中に存在することである。ここでは、イメージサイトメトリーをin vitroマクロファージ感染中?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
References
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