L'uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti
Summary
Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.
Abstract
Studi dei meccanismi di patogenesi cellulari di lieviti patogeni come la Candida albicans, capsulatum Histoplasma e Cryptococcus neoformans comunemente impiegano infezione di ospiti mammiferi o cellule ospitante (cioè macrofagi) seguita da quantificazione lievito utilizzando formanti colonie analisi unità o citometria a flusso. Mentre unità formanti colonia enumerazione è stato il metodo più comunemente utilizzato in campo, questa tecnica ha degli svantaggi e limitazioni, tra cui lenta crescita di alcune specie fungine su supporti solidi ed efficienze basse e / o variabile placcatura, il che è di particolare interesse quando si confrontano crescita di ceppi wild-type e mutanti. Citometria di flusso può fornire informazioni quantitative relative rapida vitalità del lievito, tuttavia, adozione mediante citometria a flusso per lieviti patogeni è stato limitato per una serie di ragioni pratiche tra cui il suo biosicurezza considerazioni costo elevato e. Qui, dimostriamo una immagine basata sumetodologia citometria utilizzando la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali in co-coltura con macrofagi. I nostri studi si concentrano sulla individuazione di due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum colonizza macrofagi alveolari replicando all'interno del phagosome macrofagi, e qui, abbiamo quantitativamente valutare la crescita di H. lieviti capsulatum in macrofagi RAW 264.7 con arancio di acridina / ioduro di propidio colorazione in combinazione con citometria immagine. Il nostro metodo fedelmente ricapitola i trend di crescita, misurata dalla colonia tradizionale formando unità di enumerazione, ma di un significativo aumento della sensibilità. Inoltre, valutiamo direttamente infezione di macrofagi in diretta con un ceppo GFP che esprimono di C. albicans. La nostra metodologia offre un mezzo rapido, preciso ed economico per il rilevamento e la quantificazione di importanti funghi patogeni umani in associazione spiritocellule ospiti h.
Introduction
Studi di funghi patogeni, in associazione con i loro ospiti e / o le cellule ospiti richiedono spesso quantificazione delle cellule fungine vitali corso di un corso di tempo o in diverse condizioni di infezione. Enumerazione di unità formanti colonie (CFU) è il metodo standard con cui è stato misurato il numero di cellule vitali fungine, tuttavia, questa tecnica presenta diversi inconvenienti e limitazioni. In primo luogo, molte specie fungine sono a crescita lenta. La crescita di colonie visibili su terreni solidi può richiedere 1-2 settimane, rallentando notevolmente il ritmo della ricerca. Secondo, manipolazione dei campioni durante CFU placcatura è un processo laborioso, da alcuni diluizioni devono essere placcati per assicurare un numero numerabile di colonie. Terzo, il numero di CFU è tipicamente inferiore al numero di organismi vitali piastrate poiché il rendimento placcatura è ben inferiore al 100%. Ad esempio, l'efficienza di placcatura per il dimorfismo fungino agente patogeno capsulatum Histoplasma può essere alto come il 90%, ma sono di routine a partire da30% e sono ancora più basso (10%) per il relativo fungina dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Efficienza placcatura per la Candida albicans è soggetto a variabilità 3. Infine, l'analisi CFU rappresenta solo cellule vive e dividendo attivamente capaci di instaurare crescita su terreno solido, mentre in molti casi, sarebbe utile per determinare la presenza e la concentrazione di cellule inattive morte e / o metabolicamente.
In precedenza, i metodi di citometria a flusso per la quantificazione dei vari patogeni specie fungine è stata descritta 4-6. Tuttavia, a causa di problemi di contenimento biosicurezza coinvolti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (BSL2) o patogeni BSL3 livello sul citofluorimetri condivisi, l'adozione di questa tecnica è stato limitato. Come la citometria a flusso, citometria immagine è un metodo sensibile e rapido di quantificazione delle cellule. Tuttavia, citometria immagine può essere eseguita ad una frazione del costo con risultati paragonabili 7 –11. Qui, descriviamo i metodi per l'esecuzione di citometria a immagine di funghi patogeni in associazione con cellule ospiti. Dimostriamo nostri metodi che utilizzano due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum è un patogeno fungino dimorphic che causa la malattia respiratoria, negli esseri umani, cresce come lievito in erba e si replica all'interno di macrofagi alveolari Candida albicans è una specie commensali umani che causano occasionalmente candidosi.. Abbiamo dimostrato che la citometria a immagine consente una rapida quantificazione di questi lieviti, insieme con la capacità di visualizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citometria a immagine consente di catturare immagini di alta qualità e, utilizzando software specializzati, eseguire una rapida quantificazione delle cellule. Una sfida potenziale all'adozione di citometria immagine nel campo della patogenesi microbica è che sono presenti in una popolazione mista di cellule, comprese le cellule ospiti di mammifero i microbi da contare. Qui, dimostriamo che citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali durante l'infezione in v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
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