Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין
Summary
מאמר זה מתאר כיצד microinject וקטורים ויראליים למוח עכבר ולאחר מכן לבדוק בפרדיגמה העדפת מקום ממוזגת הכוללת שלב רכישה, הכחדה והחזרה.
Abstract
Microinjecting רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים המבטאים Cre recombinase לאזורים במוח עכבר ברורים לסלקטיבי גני נוקאאוט של עניין מאפשר שליטה באופן זמני ואזורי ספציפית משופרת של מחיקת גן, בהשוואה לשיטות קיימות. אמנם גם יכולה להיות מושגת על ידי מחיקה מותנית הזדווגות עכברים שמבטאים Cre recombinase תחת שליטת יזמים גנים ספציפיים עם עכברים שנשאו גן floxed, microinjection stereotaxic מאפשר מיקוד של אזורי מוח בדידים בנקודות זמן שנקבעו הנסיין של עניין. בהקשר של העדפת קוקאין מותנית מקום, ופרדיגמות התנהגות אחרות כגון קוקאין מנהל עצמי או רגישות פסיכומוטורי שיכול להיות כרוך בנסיגה, הכחדה ו / או שלבי כינון, טכניקה זו שימושית במיוחד בחקר תרומתו הייחודית של גני המטרה ברורים לאלה שלבים של מודלים התנהגותיים של פלסטיות-Induced קוקאין. באופן ספציפי,טכניקה זו מאפשרת לאבלציה סלקטיבית של גני המטרה במהלך שלבים של התנהגות כדי לבחון את תרומתם להתנהגות על פני זמן בדידים. סופו של דבר, הבנה זו מאפשרת לתרופות ממוקדות יותר כי הם מסוגלים הטובים ביותר לטפל בגורמי הסיכון החזקים ביותר שמציגים את עצמם במהלך כל שלב של התנהגות ממכרת.
Introduction
קוקאין הוא psychostimulant מאוד מחזק. בעקבות חשיפה חוזרת ונשנית, כמה עיבודים מולקולריים ותאיים מתרחשים בפרס רלוונטי-מעגלי מוח שהם האמינו לגרום כפייתיים סמים התנהגות חיפוש, מה שגרם שיעור גבוה של הישנות אשר מהווה בעיה רצינית 1 קלינית. קוקאין מפעיל השפעות התנהגותיות ארוכת טווח אלה על ידי ויסות ביטוי גנים. כדי ללמוד את ההתאמות הנובעות משימוש בקוק כרוני, היו בשימוש נרחב במודלים של מכרסמים פרה. מודל אחד כזה הוא העדפת פרדיגמה המקום מותנה (CPP). מודל זה כולל את הפיתוח של עמותה למדה בין סביבה ניטראלית בעבר ואת המאפיינים המתגמלים של קוקאין. לאחר כמה זיווגים של קוקאין בחדר מסוים, בעלי חיים מותר לחקור בחופשיות את סביבת קוק לזווג ולא קוק לזווג ואם הם מעדיפים את תא סמים לזווג, הם אמרו שרכשו plac קוקאין-Inducedהעדפת דואר. יתר על כן, לאחר תקופת הכשרת הכחדה, יכולה לשמש פרדיגמה זו כדי ללמוד כינון הקשר ספציפי של שוחרת קוקאין התנהגות.
בהשוואה לדגמים אחרים של התנהגות כמו התנהגות ממכרת, כגון רגישות פסיכומוטורי, המשמש למחקר ארוך טווח התנהגות מושרה קוקאין ופלסטיות מולקולרית 2,3 וממשל עצמי (SA), כי הוא חשב בצורה מדויקת יותר לחקות ממכר כמו התנהגות שנמצאה בבני אדם, את הפרדיגמה CPP היא הליך פשוט ללמוד קוקאין למידה קונטקסטואלית 4. פרוטוקולי CPP יכולים להתארך בנוחות ולכלול את הכחדת שלבי שבה, בדומה לSA, המאפשר חקירה של המנגנונים שבבסיס תשוקת סמים והישנות 5-7 ואשר האמינו לשחזר היבטים של מה שמתרחש באדם תרופה שוחרת התנהגות וסמים – וקיו-Induced הישנות 8-10.
מנגנון אחד שעומד בבסיסקוקאין-induced פלסטיות התנהגותית שאופיינית לכל אחד מהשלבים שונים של CPP, כולל רכישה, הכחדה, ושבה, היא הפעלה של חתימות ייחודיות של ביטוי גנים באזורים שונים במוח. כדי לבחון ישירות אילו גנים בתוך אזורים במוח גמול רלוונטיים לתווך-Induced קוקאין שינויים התנהגותיים, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לתפעל אותם באופן סלקטיבי באופן אזורי ספציפי. אחת דרכים להשגת מטרה זו היא microinject רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים שהמפורש Cre recombinase באמצעות ניתוח stereotaxic, לאזורים במוח שונים של עכברים שיש להם גני המטרה מוקפים אתרי loxP (עכברי floxed). שיטה זו מאפשרת שליטה זמנית ואזורית מאוד מדויקת על מתי והיכן גנים ablated, בשני נוירונים מתחלקים ולא החלוקה, ללא גרימת תגובה חיסונית 11-13. רמה זו של שליטה מייצגת יתרון חשוב על פני טכנולוגיית Cre-LoxP המסורתי של רבייה עכברי floxed wעכברי ith מבטאים Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן גן אנדוגני, שבעיתוי וההפצה של מחיקת גן יכולים להיות מוסדרות יותר בחוזקה. בנוסף, נוקאאוט גן וקטור ויראלי עוקף בתיווך השפעות התפתחותיות פיצוי פוטנציאלי שעלולים להתרחש באמצעות אסטרטגיות נוקאאוט מסורתיות.
בנוסף לקוקאין CPP, שתואר כאן, microinjection של rAAV-Cre לתוך המוח של עכברי floxed כדי להעריך את התפקיד של גנים ספציפיים יכול להיות מיושם בכל מקום בגוף לפרדיגמות התנהגות הכרוכים בשלבים נפרדים, ובכלל זה ניהול עצמי ורגישות פסיכומוטורי. לדוגמה, במעבדה שלנו ניצל את טכנולוגית rAAV-Cre כדי ללמוד את התפקיד של CA v 1.2 ליטר מסוג Ca 2 + ערוצים ברגישות פסיכומוטורי קוקאין 14. באופן ספציפי, rAAV-Cre היה microinjected לתוך גרעין האקומבנס (NAC) של עכברים עם גן קידוד Ca V 1.2 floxed, על מנת להוכיח כי Ca V </sub> 1.2 הפועל באזור זה מתווך את שלב הביטוי של רגישות פסיכומוטורי 14,15. עם זאת, לא ניתן להשתמש באסטרטגיה rAAV-Cre אם עכברים עם גן floxed של עניין לא קיימים, כפי שהיה הניסיון שלנו בעת הערכת התפקיד של CA v 1.3 ליטר מסוג Ca 2 + ערוצים ברגישות פסיכומוטורי. לפיכך, מגבלה של שימוש rAAV-Cre מציגה את עצמו אם עכברים מותנים אינם קיימים לגן מסוים של עניין. עם זאת, rAAVs שsiRNA המפורש ניתן להשתמש בם למציאת גני המטרה, כפי שעשינו כדי לבחון את התפקיד של CA v 1.3 הערוצים 14,15.
Microinjecting rAAV-Cre לאזורים נפרדים במוח של עכברי floxed ולאחר מכן בודק אותם בפרדיגמה CPP מאפשר לחקירה את הגנים הספציפיים המתווכים את השלבים השונים של התנהגות דמוית הממכר ושבו הם פועלים. השימוש בפרדיגמה זו סייעה בהבנתנו כיצד ממשל קוקאין החוזר ונשנה במהות חוטפת brמעגלי גמול ains גורמים לשינויים הסתגלותי במסלולי העברת אותות מולקולריים וביטוי גנים שיובילו למדינה המכורה 1,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
אזורי ואבלציה גן temporally הספציפית באמצעות microinjection stereotaxic של וקטורים ויראליים בשילוב עם CPP הכולל הכחדה ושלבי כינון מאפשרת חקירה של התרומות הספציפיות של גנים לשלושה שלבים ברורים של התנהגות דמוית ממכרת. בעוד נוקאאוט המותנה שמושג תוך ניצול מערכת Cre-LoxP המסורתי מספק למרחב ב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאנני לי ומורין בירן על עזרתם בהקמת פרוטוקול העדפת המקום המותנה הממושך.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
References
- Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
- Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
- Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
- Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
- Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
- Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
- Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
- O’Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications – Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
- Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
- Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
- Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
- Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
- Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
- Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
- Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
- Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
- Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
- Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors – art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
- Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
- Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9 (2005).
- Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
- Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
- Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
- Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses – normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
- Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
- Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).
