Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel
Summary
Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.
Abstract
Kweken van cellen in 3D geschikte steigers wordt gedacht dat de in vivo micro beter nabootsen en meer cel-cel interacties. De resulterende 3D cellulaire construct kan vaak relevanter voor onderzoek naar de moleculaire gebeurtenissen en cel-cel interacties dan vergelijkbare experimenten onderzocht 2D. Om een effectieve 3D culturen levensvatbaarheid hoge cel gedurende het skelet creëren kweekomstandigheden zoals zuurstof en pH moeten zorgvuldig worden gecontroleerd als hellingen analyt concentratie bestaan binnen het 3D construct. Hier beschrijven we de methoden van de voorbereiding biocompatibel pH responsieve sol-gel nanosensoren en worden geïntegreerd in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers samen met hun verdere voorbereiding op de cultuur van zoogdiercellen. De pH responsieve steigers kunnen worden gebruikt als instrumenten om microenvironmental pH bepalen binnen een 3D cellulaire construct. Verder hebben we uitvoerig de levering van pH responsieve nanosensors de intracellulaire omgeving van zoogdiercellen waarvan de groei werd ondersteund door electrospun PLGA steigers. De cytoplasmatische locatie van de pH responsieve nanosensors kan worden gebruikt om de intracellulaire pH (pHi) volgen tijdens lopende experimenten.
Introduction
Een belangrijke strategie weefselengineering is het gebruik van biocompatibele materialen steigers morfologie die lijkt op het weefsel dat het zal vervangen en kan ook ondersteuning van de groei en functie 1,2 cel fabriceren. De steiger verschaft mechanische ondersteuning doordat celhechting en-proliferatie toch laat celmigratie gedurende de tussenruimten van een 3D cellulaire construct. De steiger moet ook zorgen voor het massatransport van cel voedingsstoffen en verwijdering van metabolische afvalproducten 3 niet remmen.
Electrospinning is ontstaan als een veelbelovende methode voor de vervaardiging van polymere scaffolds kan ondersteunen celgroei 4-6. De niet-geweven electrospun vezels geproduceerd zijn geschikt voor celgroei omdat ze vaak poreus en laat cel-cel interacties en celmigratie gedurende de tussenruimten van een 3D cellulaire construct 7. Het is belangrijk om cellevensvatbaarheid te controleren tijdens tHij periode van cultuur en die cellevensvatbaarheid behouden blijft gedurende de gehele 3D-construct. Bijvoorbeeld kweekomstandigheden zoals zuurstof en pH vereisen zorgvuldige controle, gradiënten analyt concentratie bestaan binnen het 3D-construct. Bioreactoren of perfusie systemen kunnen worden gebruikt om de in vivo omstandigheden na te bootsen van interstitiële stroom en als gevolg toename nutriëntentransfers en metabole afvalverwijdering 8. De vraag of dergelijke systemen zorgen voor een constante micro-omgeving van omstandigheden kan worden aangepakt door het beoordelen van de cellulaire micro-omgeving in real-time.
Belangrijke micromilieu statistieken die kunnen worden in real time omvatten: temperatuur, chemische samenstelling van celmedium, concentratie van opgeloste zuurstof en kooldioxide, pH en vocht. Van deze statistieken, kan de temperatuur de meeste gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van in situ sondes. Voor de controle van de overige vermelde metrics vaak involve verwijdering van een monster voor de bemonstering en daarom verstoren de celcultuur en verhogen het risico op besmetting. Continue, real-time methoden worden gezocht. Huidige controlemethoden, meestal rekenen op instrumenten die fysiek sonde de cellulaire constructie zoals een pH-monitor of zuurstof sonde. Toch kunnen deze indringende methoden de cellulaire constructie beschadigen en verstoren de lopende experiment. Niet-invasieve bewaking van analytconcentraties binnen de 3D-constructie kan real-time monitoring van de verschillende milieuaspecten, zoals een tekort aan nutriënten 9 staat. Dit zou de beoordeling van voedingsstoffen laten diepere regionen binnen de structuur en bepalen of metabolisch afval werd effectief 10,11 verwijderd. Systemen die trachten het probleem van invasiviteit pakken algemeen de toepassing van een perfusie kamer die kweekmedium passeert zowel kweekvat en externe sensoren te controleren pH, zuurstof en glucose 12. Dere een toenemende belangstelling voor het ontwikkelen sensoren die direct kan worden geïntegreerd in het kweekvat dat geen verwijdering van een hoeveelheid voor bemonstering vereisen en als zodanig in situ bewaking zou bieden.
Om dergelijke tekortkomingen voor in situ en niet-invasieve monitoring van microenvironmental voorwaarden die we hebben analyt responsieve nanosensors opgenomen in electrospun steigers om zelfrapportage steigers 13 te produceren. Steigers die als sensoren fungeren door toezicht fluorescentie activiteit zijn eerder bereid, waarbij de sensor is zowel het werkelijke polymère steiger door electrospinning of door het gebruik van een analyt reageren kleurstof die wordt opgenomen in het polymeer vóór steiger vorming 14,15 . Echter, deze aftastinrichtingen het potentieel foutieve optische uitgangen veroorzaakt door mogelijke interferentie van andere analyten te geven. Het gebruik van een ratiometrische sensor such als die bereid in het protocol beschreven heeft het potentieel om deze mogelijke bijwerkingen te elimineren en een respons specifiek voor de analyt in kwestie.
De electrospun steigers hier gepresenteerd zijn bereid uit de synthetische co-polymeer poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA), geselecteerd als gevolg van het hebben van Food and Drug Administration (FDA) goedkeuring, ten gevolge van zijn biologisch afbreekbaar en biocompatibel eigenschappen en een track verslag van ondersteunen van de groei en functie van diverse celtypen 16-18. De bereide ratiometrische analyt reageren nanosensors reageren op pH. De nanosensors bevatten twee fluorescerende kleurstoffen in een biocompatibele sol-gel-matrix waarbij een kleurstof, FAM reageert op pH en andere, TAMRA fungeert als interne standaard omdat het niet reageert op pH. Verder is de fluorescentie van zowel FAM en TAMRA kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd niet wezenlijk overlappen. Bepalen van de verhouding van de fluorescentie emission beide kleurstoffen op specifieke golflengten geeft een pH reactie onafhankelijk van andere omgevingsfactoren. De zelf-rapporterende steigers kunnen herhaalde beoordeling van de pH in situ en in real-time mogelijk zonder verstoring van de ontwikkelde 3D-model. We hebben aangetoond dat deze steigers kunnen ondersteunen celhechting en proliferatie en reageert op de analyt in kwestie blijven. De kinetiek van zure bijproducten engineered constructen blijft weinig bestudeerd en als zodanig behulp van de pH responsieve steigers danig dergelijke studies vergemakkelijkt 19. Bovendien is het gebruik van het zelf-rapporterende draagstructuren voor weefselregeneratie toepassingen biedt de mogelijkheid om volledig te begrijpen, controleren en optimaliseren van de groei van 3D-model weefselconstructen in vitro noninvasively en in real-time.
De pH responsieve nanosensors zijn ook de intracellulaire omgeving van fibroblasten gekweekt op electrospun PLGA scaffol geleverdds. De verhouding van de fluorescentie emissie van de kleurstoffen werden gebruikt voor het bewaken pHi en vergeleken met een zelf-rapporterende steiger Integratie pH nanosensors. De levering van nanosensors aan cellen gekweekt in een 3D omgeving kan monitoring van analytconcentratie diep in het construct in een niet-destructieve manier mogelijk te maken. Daarom nanosensors kan een levensvatbare imaging tool om het gedrag van cellen niet-destructief evalueren hele 3D construeert waardoor op lange termijn analyse. Screening van de analytconcentratie van individuele cellen binnen een 3D-constructie kan ervoor zorgen dat ze krijgen voldoende voedingsstoffen en zuurstof concentraties. Monitoring procesparameters kunnen helpen bij de ontwikkeling van gestandaardiseerde technieken voor de effectieve massa transport van zuurstof en voedingsstoffen. De levering van nanosensors aan de intracellulaire milieu en integratie van nano-sensoren in polymere steigers kunnen worden gecombineerd om de beoordeling van de levensvatbaarheid cel evenals steiger prestaties toestaan binnen 3D constructs tijdens het weefsel groeiproces. Dit kan leiden tot meer kennis over deze constructen en de voortgang van de fabricage van biologisch relevante weefsel vervangers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tissue engineering streeft biologische substituten te maken die gebruikt kan worden zowel in vivo als in vitro modellen weefsel en weefsel vervangingstherapie tot reparatie, vervanging, handhaven of verbeteren van de functie van een bepaald weefsel of orgaan. Synthetische substituten zijn gebruikt voor vele jaren vervangen of steun herstel van weefsels, maar deze vaak niet vanwege slechte integratie met gastheerweefsel en / of infectie, wat uiteindelijk leidt tot afstoting of verder revisiechirurgie. H…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering van de BBSRC wordt vriendelijk erkend (licentienummer BB H011293 / 1).
Materials
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?. Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 – 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
