Tomat / GFP-FLP / FRT metode indebærer at visualisere mosaik fotoreceptorceller i levende Drosophila. Det kan bruges til at følge de enkelte fotoreceptor celleskæbner i nethinden dage eller uger. Denne metode er ideel til undersøgelser af retinal degeneration og neurodegenerative sygdomme eller fotoreceptorer celle udvikling.
Drosophila-øje er almindeligt anvendt som en model til undersøgelser af udvikling og neuronal degeneration. Med den kraftfulde mitotisk rekombination teknik, har elegante genetiske skærme baseret på klonal analyse førte til identifikation af signalveje, der er involveret i udvikling øje og fotoreceptorer (PR) differentiering larvestadier. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT metode, som kan anvendes til hurtig klonal analyse i øjet af levende voksne Drosophila. Fluorescerende fotoreceptorceller afbildes med hornhinden neutralisering teknik på nethinder med mosaik kloner dannet ved flipase-medieret rekombination. Denne metode har flere vigtige fordele i forhold til klassiske histologiske sektionering af nethinden: det kan anvendes til high-throughput screening, og har vist sig at være en effektiv metode til at identificere de faktorer, der regulerer PR overlevelse og funktion. Det kan bruges til kinetiske analyser af PR degeneration i den samme levende Animal over flere uger, for at demonstrere kravet om specifikke gener for PR overlevelse eller funktion i den voksne flue. Denne metode er også nyttigt for at tage celle autonomi spørgsmål udviklingsmæssige mutanter, såsom dem, hvor etableringen af plane celle polaritet påvirkes.
Drosophila-nethinden er sammensat af omkring 800 ommatidial enheder (figur 1A), som er præcist tilrettelagt, med en klart defineret akse polaritet (figur 1B). Hver enhed indeholder 20 celler: otte fotoreceptorceller (PRS) og 12 tilbehør celler, herunder kegle celler, pigment celler og stritter celler 1,2. To klasser af PR skelnes på grundlag af den type rhodopsin (RH) de udtrykker. De seks ydre PRs (R1-6) udtrykker RH1 og er anbragt i et trapezformet mønster (figur 1C). I centrum af den trapez, de to indre PRS (R7/R8) udtrykker fire mulige typer af rhodopsin (RH3, RH4, RH5 eller RH6) og er organiseret således, at R7 ligger på toppen af R8 3..
Mere end 2.500 gener er involveret i morfogenese af Drosophila øje 4, som har været en meget kraftig model til undersøgelser af et bredt panel af processer, herunder øje develing, PR rekruttering, differentiering plane cellepolaritet morfogenese, overlevelse, apoptose og visuel transduktion 5-9.
Forskere arbejder på Drosophila øje har gennem mange år udviklet teknikker til billedbehandling nethinden og udfører systematisk genetiske skærme. Den nemmeste måde at billedet voksne nethinden er at se på hornhinden i et immobiliseret dyr (figur 1A). Strukturen af hornhinden kan visualiseres præcist ved scanning elektronmikroskopi og blev anvendt i en storstilet genetisk skærmen af URCFG konsortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Dette er en meget effektiv metode til at visualisere globale morfologiske ændringer i hornhindens struktur, såsom øjet ujævnhed eller glans, ofte induceret af mutationer i gener, der kontrollerer de tidlige stadier af udvikling eller cellelevedygtighed. Imidlertid er den globale visualisering af hornhinden ikke sufficient at identificere de faktorer, der regulerer PR rhabdomere morfogenese eller voksen PR levedygtighed og funktion. Sådanne analyser kræver en mere grundig undersøgelse af PR integritet baseret på fase-kontrast mikroskopi af tangentielle semi-tynde harpiks dele af nethinden 11-13. Denne teknik er egnet til mosaik analyser, hvor mutant PRs kan identificeres ved deres mangel på røde pigment 14,15.
Mosaic mutantklonerne kan også visualiseres i hel-mount dissektioner af puppe eller voksen retina på baggrund af deres mangel på grønt fluorescerende protein (GFP) signal på fluorescensmikroskopi 16,17. Disse to teknikker er meget nyttige, men begge er arbejds-og tidskrævende og er derfor ikke egnet til produktion i stor skala screening. Vi og andre har udviklet brugen af hornhinden neutralisations teknikker til billeddannelse af PRS producerer fluorescerende proteiner 18,19, for at lette hurtig PR analyser. Med denne teknik, mutantkan identificeres kloner på basis af autofluorescens af den røde (w +) pigment i mosaik voksne Drosophila kloner. Denne metode ikke giver dog encellede opløsning kræves for at løse celle autonomi spørgsmål 19. Vi overvandt dette problem ved at udvikle Tomat / GFP-FLP / FRT metode, som kombinerer billeddannelse af fluorescerende proteiner ved hornhinden neutralisering med mitotisk rekombination 20. Denne metode giver den højt gennemløb, hurtig og præcis identifikation af mutant PRs i mosaik kloner på encellede opløsning ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Den er velegnet til brug i kinetiske analyser, for at følge de enkelte PRs over en periode på uger i levende Drosophila. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT-metoden og tips til brug i enkle, kinetiske analyser af mosaik øjne.
Drosophila øje har været meget anvendt til at dechifrere de signalveje, der regulerer udvikling, spredning og overlevelse. I begyndelsen af 1990'erne blev en lang række genetiske skærme udføres for at identificere de veje, der kræves i de indledende faser af PR-udvikling 25-27. Effektiviteten af genetiske skærme blev øget kraftigt af den mitotiske rekombinationsteknik, hvilket gør det muligt at teste tab af funktion mutationer i mosaik kloner 21. Derfor kan den rolle af embryonale letale mutationer systematisk testes i homozygote mutante kloner i øjnene af fluer, der ellers var heterozygote. De fleste mosaik screeninger har fokuseret på den tidlige PR rekruttering, differentiering axonale projektion eller morfogenese forekommer i larver eller pupper 10,25-31 udvikling. Til dato har kun én mosaik skærm undersøgt de mekanismer, der regulerer voksen PR-funktion, ved at overvåge den visuelle respons via electroretinOGRAM recordings 32.. Med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden og muligheden for at udføre tidsforløbsanalyse i levende muterede dyr, har vi designet en ny metode til at identificere de faktorer, der regulerer voksen PR levedygtighed og funktion 20,24.
Tomat / GFP-FLP / FRT metode har flere store fordele i forhold til den klassiske histologiske sektionering af harpiks-embedded øjne. Først denne metode er meget hurtigere, billigere og lettere at udføre end den histologiske metode, forudsat at et fluorescensmikroskop udstyret med en passende vand dypning mål er til rådighed (se tabel af reagenser og udstyr). For det andet kan Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden anvendes i forbindelse med transgen udtryk som udtryk for P (UAS, w +), bærer en mini-hvid transgen. I modsætning til histologiske snit, hvor w + anvendes til klonal påvisning, i tomat / GFP-FLP / FRT-system, P (UAS, w +) ikke interfererer med klonal detection baseret på Tomat fluorescerende protein. Brug P (UAS-fatp, w +) transgene fluer, var vi i stand til at visualisere redning af fatp mutant PRS (figur 7). For det tredje, en vigtig faldgrube af alle typer af klonal analyse, herunder at baseret på tomat / GFP-FLP / FRT, er tvetydigheden i genotype af tabte PRS. Faktisk kan det være uklart, om et PR er fraværende på grund af manglen på et bestemt gen funktion eller på grund af en celle non-autonom effekt, især ved grænsen til mutanten klon. Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden får omkring dette problem for degeneration ved at gøre det muligt at følge vildtype og mutant PRs i samme dyr over perioder på flere uger. Vi var i stand til at følge den skæbne enkelte PRS kinetiske analyser på forskellige fatp mutant fluer (figur 6). Det samme klon kan genkendes i et givet dyr på forskellige tidspunkter på grund af den præcise form af de omgivende vildtype-kloner. Vi var i stand til at vise entydigly at alle de manglende PRs var mutant for fatp, hvilket indikerer, at den rolle fatp mutanter i PRS celle-autonome. Således ved at overvåge tabet af PRS i en kinetisk analyse, er det muligt at bestemme genotypen PRS i modeller af voksen-debut degeneration. Endelig har tomat / GFP-FLP / FRT-metoden vist sig meget stærk til identifikation af faktorer, der regulerer oprettelsen af PCP 20.. Muligheden for at udføre et stort antal mosaik ommatidia til polaritet fænotype uden behovet for dele, muliggør hurtig bestemmelse af PR kravet om indførelse af PCP. Ikke desto mindre ville finere analyse af PR integritet kræver traditionel sektionering efterfulgt af fase-kontrast eller elektroniske microscopies.
Afslutningsvis Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden åbner op for nye muligheder for effektiv mosaik screening for at identificere faktorer, der regulerer PR udviklingsprocesser og voksen PR funktioner, såsom VISual respons og levedygtighed.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM og Droso-Tools faciliteterne i UMS3444 Biosciences, Lyon, Frankrig. BM forskning blev støttet af tilskud fra Fondation pour la Recherche Médicale fra CNRS (ATIP) og ANR-12-BSV1-0019-01. PD blev støttet af Retina Frankrig foreningen og Ecole Normale Supérieure i Lyon (Frankrig). CL blev støttet af La Ligue Nationale contre le Cancer Association.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |