माउस और मानव आंतों के ऊतकों से प्राथमिक myofibroblasts का अलगाव
Summary
myofibroblast सामान्य और बीमारी दोनों राज्यों में महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग के एक प्रभावशाली stromal सेल है. हम माउस और इन विट्रो प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो मानव पेट के ऊतक, दोनों से प्राथमिक myofibroblasts के अलगाव के लिए अनुमति देता है एक तकनीक का वर्णन.
Abstract
myofibroblast कई सैनिक कार्यों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए काफी ध्यान प्राप्त किया गया है कि जठरांत्र (सैनिक) पथ का एक stromal सेल है. कई myofibroblast सेल लाइनों विट्रो में इन कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, प्रयोगात्मक सेल संस्कृति की स्थिति से अवगत कराया एक सेल लाइन से शोध के परिणामों काम की पीढ़ी न्यूनकारी प्रकृति के कारण अंतर्निहित सीमाएँ होती हैं. प्राथमिक myofibroblasts का प्रयोग एक सेल लाइन में पहचान की प्रयोगात्मक निष्कर्षों की पुष्टि के मामले में एक महान लाभ प्रदान करता है. एक पशु मॉडल से प्राथमिक myofibroblasts के अलगाव और अधिक बारीकी से रोग राज्य अध्ययन किया जा रहा है कि नकल की शर्तों के तहत myofibroblasts के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. कोशिकाओं अंतर्निहित रोग के साथ रोगियों से सीधे आने के बाद से मानव पेट के ऊतक से प्राथमिक myofibroblasts के अलगाव, यकीनन सबसे प्रासंगिक प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करता है. हम यू हो सकता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक का वर्णनमाउस और मानव पेट के ऊतक दोनों से प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए tilized. ये अलग कक्षों subepithelial आंतों myofibroblasts साथ संगत अल्फा चिकनी पेशी actin और vimentin पॉजिटिव, और desmin नकारात्मक होने का लक्षण वर्णन किया गया है. प्राथमिक myofibroblast कोशिकाओं सेल संस्कृति में बड़े और मार्ग की एक सीमित संख्या में प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
जठरांत्र (सैनिक) पथ समारोह के नियमन mucosal परत और उसके अंतर्निहित mesenchyme के बीच जटिल, गतिशील बातचीत शामिल है. इन मुलाकातों सामान्य रूप से homeostasis को बनाए रखने के लिए की सेवा भी है लेकिन वैकृत शर्तों 1 के तहत रोग राज्यों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Myofibroblasts mucosal उत्थान, मरम्मत, और फाइब्रोसिस 2 शामिल है कि महत्वपूर्ण सैनिक पथ प्रक्रियाओं की एक संख्या को विनियमित करने के लिए सेल subpopulations आसपास के साथ एक पैराक्राइन फैशन में संवाद है कि उपकला परत को आधारस्थित स्थित stromal कोशिकाओं के एक subpopulation हैं.
यह सीटू myofibroblasts में प्राथमिक की विशेषताओं के कई शेयरों क्योंकि 18Co सेल लाइन व्यापक रूप से myofibroblast समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक मानव colonic myofibroblast सेल लाइन का एक उदाहरण है. ये प्रोटीन एक चिकनी पेशी actin की अभिव्यक्ति (α-SMA) और vimentin, साथ ही एक नंबर की अभिव्यक्ति में शामिलऐसे epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर, या lysophosphatidic एसिड 3,4 के लिए रिसेप्टर्स के रूप में कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की. क्योंकि इन साझा ultrastructural विशेषताओं, साथ ही जीवविज्ञान कार्य 5 में समानता की, 18Co सेल लाइन सूजन आंत्र रोग या कोलोरेक्टल कैंसर 3,6 के रूप में कई रोग राज्यों के संदर्भ में myofibroblast समारोह का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, एक सेल लाइन का उपयोग करते समय निहित सीमाओं और चिंताएं हैं. ये विकास दर और अन्य सेल आबादी के साथ बातचीत सहित सेल के phenotype और जीवविज्ञान कार्य, फेरबदल, प्राथमिक कोशिकाओं से कोशिका लाइनों को अलग करता है कि समय के साथ genotypic अस्थिरता शामिल हैं. सेल लाइनों भी इसके उपयोग के लिए एक प्रमुख सीमा है जो सैनिक microenvironment (उपकला, stromal, और संवहनी घटक), के सामान्य घटकों की कमी है. इसलिए, प्रयोगात्मक सेल लाइन अनुसंधान से निष्कर्ष निकाला आरआई को कम करने के लिए आगे सत्यापन की आवश्यकताअशुद्ध अर्थ के एस.
प्राथमिक myofibroblasts एक सेल लाइन 7 में पहचान की प्रयोगात्मक निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए मानव और माउस पेट के ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता है. विधि मूल रूप से महीदा, एट अल. 8 द्वारा वर्णित है, और हमारे प्रोटोकॉल माउस और मानव पेट के 9 से प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि बहुत अच्छी तरह से वर्णित तकनीकों में से एक है. Colonic रोग के किसी भी माउस मॉडल के लिए, इस तकनीक वे पड़ोसी कोशिकाओं के साथ बातचीत कैसे अध्ययन या सामान्य या नैदानिक सैनिक 10,11 प्रक्रियाओं दोनों में योगदान के लिए प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक myofibroblasts चिकित्सा, फाइब्रोसिस, और कोलोरेक्टल adenomas और कार्सिनोमा के विकास mucosal के लिए योगदान कैसे अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्राथमिक myofibroblasts भी सौम्य (सूजन आंत्र रोग, strictures, विपुटीप्रदाह) या घातक ग के लिए आपरेशन के समय में resected किया गया है कि मानव पेट के ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता हैonditions. मानव और माउस पेट के ऊतकों से अलग प्राथमिक कोशिकाओं सेल संस्कृति में बड़े और मार्ग की एक सीमित संख्या में उपयोग किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
माउस या मानव बृहदान्त्र या तो उपयोग करते समय सामान्य तकनीक के समान है. इस तकनीक को भी छोटी आंत से myofibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 1 से myofibroblasts के अलगाव के लिए विशिष्ट विवरण. माउस और 2. मानव पेट क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के जे के लिए स्वास्थ्य अनुदान 5KO8DK085136-02 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
