Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue
Summary
De myofibro is een invloedrijke stromale cellen van het maagdarmkanaal die belangrijk zijn fysiologische processen reguleert zowel in normale als ziektebeelden. We beschrijven een techniek die voor de isolatie van primaire myofibroblasten van zowel muis als humaan colon weefsel, dat kan worden gebruikt voor in vitro experimenten.
Abstract
De myofibroblast is een stromale cel van de gastro-intestinale (GI) stelsel dat is steeds veel aandacht voor de cruciale rol in vele GI functies. Terwijl verscheidene myofibro cellijnen zijn commercieel beschikbaar om deze cellen te bestuderen in vitro onderzoeksresultaten uit een cellijn blootgesteld aan experimentele celkweekomstandigheden hebben inherente beperkingen als gevolg van de al te reductionistische aard van het werk. Gebruik van primaire myofibroblasts biedt een groot voordeel in termen van het bevestigen van de experimentele bevindingen die in een cellijn. Isolatie primaire myofibroblasten van een diermodel maakt de studie myofibroblasten onder omstandigheden die beter nabootsen ziektetoestand onderzocht. Isolatie van primaire myofibroblasten uit menselijke dikke darm weefsel biedt misschien wel de meest relevante experimentele gegevens, omdat de cellen komen rechtstreeks van de patiënten met de onderliggende ziekte. We beschrijven een gevestigde techniek die u kunt wordentilized primaire myofibroblasts isoleren van zowel muis als mens darmweefsel. De geïsoleerde cellen werden gekenmerkt alfa-gladde spier actine en vimentine-positief en desmine-negatieve, overeenkomstig subepitheliale intestinale myofibroblasten zijn. Primaire myofibroblast cellen kunnen worden gekweekt in celkweek en gebruikt voor experimentele doeleinden over een beperkt aantal passages.
Introduction
De regulering van gastro-intestinale (GI) stelsel functie gepaard met complexe, dynamische interacties tussen de mucosale laag en de onderliggende mesenchym. Deze interacties normaal dienen om homeostase te behouden, maar kan ook leiden tot de ontwikkeling van ziektetoestanden onder pathologische omstandigheden 1. Myofibroblasten zijn een subpopulatie van stromale cellen die zich onderliggend aan de epitheliale laag die in een paracriene wijze communiceren met de omliggende cel subpopulaties een aantal kritische maagdarmkanaal processen mucosale regeneratie, reparatie en fibrose 2 omvatten regelen.
De 18Co cellijn is een voorbeeld van een menselijk colon myofibroblast cellijn die wijd gebruikt myofibroblast functie te bestuderen omdat zijn veel kenmerken van primaire in situ myofibroblasten. Deze omvatten de eiwitexpressie van een gladde spier actine (α-SMA) en vimentine, alsmede de expressie van een aantalceloppervlakreceptoren zoals de epidermale groeifactor receptor of receptoren voor lysofosfatidezuur 3,4. Door deze gedeelde ultrastructurele kenmerken en gelijkenissen in biologische functie 5 heeft de 18Co cellijn uitgebreid gebruikt om myofibroblast functie te bestuderen in de context van vele ziektetoestanden zoals inflammatoire darmziekte of colorectale kanker 3,6. Echter, er zijn inherente beperkingen en problemen bij het gebruik van een mobiele lijn. Deze omvatten genotypische instabiliteit tijd die cellijnen van primaire cellen onderscheidt, veranderen het fenotype en biologische functie van de cel, waaronder groei en interacties met andere celpopulaties. Cellijnen missen ook de normale bestanddelen van de micro GI (epitheliale, stromale en vasculaire componenten), die een belangrijke beperking voor het gebruik ervan. De conclusies getrokken uit de experimentele cellijn onderzoek vereist verdere validatie van de ri verminderensk van misinterpretatie.
Primaire myofibroblasten kan worden verkregen bij mens en muis colon weefsel om experimentele bevindingen die in een cellijn 7 bevestigen. De methode werd oorspronkelijk beschreven door Mahida, et al.. 8 en ons protocol is een van vele goed beschreven technieken kunnen worden gebruikt om primaire myofibroblasten isoleren van muis en humane colon 9. Voor elk muismodel van colon-en vaatziekten, kan deze techniek worden gebruikt om primaire myofibroblasts isoleren om te bestuderen hoe ze omgaan met naburige cellen of bijdragen aan zowel normale of pathologische GI verwerkt 10,11. Deze techniek kan worden gebruikt om te bestuderen hoe myofibroblasts bijdragen aan genezing, fibrose, en de ontwikkeling van colorectale adenomen en carcinomen mucosale. Primaire myofibroblasten kan ook worden verkregen uit colon weefsel dat is weggesneden bij de verrichting voor goedaardige (ontstekingsdarmziekte, stricturen, diverticulitis) of kwaadaardige caarden. Geïsoleerde primaire cellen van mens en muis colon weefsel kan worden gekweekt in celkweek en gebruikt op een beperkt aantal passages.
Protocol
Representative Results
Discussion
De algemene techniek lijkt goed wanneer de muis of colon. Deze techniek kan ook worden gebruikt om myofibroblasten isoleren van de dunne darm. Specifieke details voor de isolatie van myofibroblasten van 1. muis en 2. colon worden hieronder besproken.
1. Muis Colon
Irrigatie van de muis colon wordt vergemakkelijkt door het bevestigen van een in 4, 16 G Popper stompe einde naald aan een uiteinde van de dikke darm. Dit helpt ook bij het snijden van de dikke darm in de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 te JY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
