בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל
Summary
הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.
Abstract
הכבד, איבר עם יכולת התחדשות יוצאת דופן, מבצע מגוון רחב של פונקציות, כגון סילוק רעלים, חילוף חומרים ועל הומאוסטזיס. ככזה, hepatocytes הוא מודל חשוב למגוון רחב של שאלות מחקר. בפרט, השימוש בhepatocytes האנושי הוא חשוב במיוחד בתחומי פרמקוקינטיקה, טוקסיקולוגיה, התחדשות כבד ומחקר translational. לכן, שיטה זו מציגה גרסה שונה של הליך זלוף collagenase שני שלבים לבודד hepatocytes כפי שתואר על ידי 1 Seglen.
בעבר, hepatocytes היה מבודד בשיטות מכאניות. עם זאת, שיטות אנזימטיות הוכחו להיות מעולה כמו hepatocytes לשמור על השלמות המבנית שלהם ותפקוד לאחר בידוד. שיטה זו המוצגת כאן מתאים את עצמו בשיטה שנועדה בעבר לכבדי חולדה לחתיכות כבד אנושיות ותוצאות בתשואה גדולה של הפטוציטים עם כדאיות של 77 10% ±. העיקריהבדל בהליך זה הוא התהליך של cannulization של כלי הדם. יתר על כן, בשיטה שתוארה כאן יכולה להיות מיושמת גם לכבדים ממינים אחרים עם גדלים בכבד או בכלי דם דומים.
Introduction
השעיה תא כבד ניתן להכין מהכבד בשיטות מכאניות או אנזימטי. שיטות מכאניות המשמשות להכנת תאי כבד שלמים כוללות כפייה של כבד דרך הגזה 2, רועד חתיכת כבד עם חרוזי זכוכית שייקרה קאהן 3, באמצעות homogenizers זכוכית עם עלי רופף 4,5 וכו 'במהלך השנים, שיטות מכאניות נפלו מתוך להעדיף בשל הנזק לקרומי תאים ואובדן התפקוד של הפטוציטים המבודדים 6,7. כתוצאה מכך, השימוש בשיטה אנזימטית הוא כיום השיטה העיקרית לבידודה של הפטוציטים.
בידוד של hepatocytes באמצעות שיטה האנזימטית השתפר מאוד כאשר ברי והחבר 8 perfused collagenase וhyaluronidase דרך כבד דרך וריד הפורטל בחולדות. תהליך זה מנוצל זלוף כלי הדם כדי לאפשר לאנזימים לבוא במגע קרוב עם רוב של התאים, מה שמוביל לעלייה של פי 6 בתשואה של hepatocytes 8. יתר על כן, שיטה זו הניבה תאים ששמרו על השלמות המבנית שלהם, עם כמעט ללא שינוי של reticulum endoplasmic לתוך שלפוחית מבודדת ולא נגרם נזק המיטוכונדריה 8.
שיטה זו שונה על ידי 1 Seglen, שהיה חלוץ הליך זלוף שני שלבים לבידוד בתאים כבד. בהליך זה, בכבד חולדת perfused עם 2 + חיץ חופשי Ca אחרי זלוף עם חיץ collagenase המכיל Ca 2 + 1. ההסרה של Ca 2 + בשלב הראשון מסייעת לשבש דסמוזומים, תוך התוספת של Ca 2 + בשלב השני נדרשת לפעילות collagenase אופטימלית 1,9.
בהתחשב בכך שהעבודה שפורסמה שתוארה לעיל בוצעה בחולדות, מאמר זה נועד להדגים הליך שונה שיכול לשמש לבידודה של הפטוציטים עם כדאיות גבוהה מזמזוםכבדים. השימוש בhepatocytes האנושי נשאר חשוב למחקר translational ולאימות ניסויים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים. חתיכות הכבד האנושיות השתמשו במחקר זה נרכשו בהסכמה לממשל דרך הקרן לחקר רקמות ותאים אנושיים, קרן ללא כוונת רווח בשליטה ממשלתית 10. לאחר הפתולוג הסיר את מה שנדרש לאבחון, חתיכות כבד נאספו מהרקמות שנותרו. הרקמה מחולק על ידי פתולוג הייתה מורפולוגית רקמה בריאה המתקבלת משולי כריתה לאחר כריתת כבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה גורם לבידוד של hepatocytes האנושי עם כדאיות גבוהה ובטהרה. על מנת להשיג את התוצאות הללו, חשוב להתחיל עם חתיכת הכבד מתאימה. חתיכת הכבד צריכה הכמוסה של Glisson שלמות על כל המשטחים, פרט למשטח לחתוך 1. גורם חשוב נוסף הוא אצווה המסוים של collagenase משמש, כפי שקבוצות שונות יכולו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה הודות לקרן הרקמה האנושית וחקר תא, מה שהופך את הרקמות אנושיות זמינות למחקר. תמיכה כספית עבור עבודה זו קיבלה מהמשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (שם מענק: כבד רשת וירטואלית, מספר מענק: 0,315,759) וHepacult GmbH. תודתנו גם ללכת לעוזרים הטכניים מבנק רקמות Grosshadern בית החולים לאיסוף הדגימות הכבד והעוזרים הטכניים ממתקן Core בידוד תא לביצוע זלוף הכבד ובידוד הפטוציט. בפרט, אנו רוצים להודות לNatalja Löwen עבור הוכחת בהליך זה בווידאו. לבסוף, ברצוננו להודות לNatalja Löwen וEdeltraud Hanesch ליצירת האיורים לאיור 1 ודמויות בסקירה סכמטית של הווידאו.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology–head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
