एक दो कदम Collagenase छिड़काव प्रक्रिया द्वारा मानव hepatocytes का अलगाव
Summary
मानव hepatocytes के अलगाव के लिए एक संशोधित दो कदम collagenase छिड़काव प्रक्रिया में वर्णित है. यह विधि भी अन्य स्तनधारी यकृत के लिए लागू किया जा सकता है. पृथक hepatocytes उन्हें ऐसे जिगर उत्थान, फार्माकोकाइनेटिक्स और विष विज्ञान जैसे क्षेत्रों में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाने, उच्च उपज और व्यवहार्यता में उपलब्ध हैं.
Abstract
जिगर, एक असाधारण उत्थान क्षमता के साथ एक अंग है, इस तरह के detoxification, चयापचय और homeostasis के रूप में कार्य करता है की एक विस्तृत श्रृंखला, बाहर किया जाता है. जैसे, hepatocytes अनुसंधान सवालों की एक विशाल विविधता के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल हैं. विशेष रूप से, मानव hepatocytes के उपयोग फार्माकोकाइनेटिक्स, विष विज्ञान, जिगर उत्थान और शोधों के क्षेत्र में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, इस विधि Seglen 1 द्वारा वर्णित के रूप में hepatocytes अलग करने के लिए एक दो कदम collagenase छिड़काव की प्रक्रिया का एक संशोधित संस्करण प्रस्तुत करता है.
इससे पहले, hepatocytes यांत्रिक विधियों से पृथक किया गया है. हालांकि, एंजाइमी तरीकों hepatocytes अलगाव के बाद उनकी संरचनात्मक अखंडता और समारोह को बनाए रखने के रूप में बेहतर होना दिखाया गया है. यहाँ प्रस्तुत यह विधि 77 ± 10% की व्यवहार्यता के साथ hepatocytes के एक बड़े उपज में मानव जिगर के टुकड़े और परिणाम के लिए चूहा यकृत के लिए पहले से बनाया गया विधि adapts. मुख्यइस प्रक्रिया में अंतर रक्त वाहिकाओं के cannulization की प्रक्रिया है. इसके अलावा, यहां वर्णित विधि भी तुलनीय जिगर या रक्त वाहिका आकार के साथ अन्य प्रजातियों से यकृत के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
एक जिगर सेल निलंबन यांत्रिक या एंजाइमी तरीकों से जिगर से तैयार किया जा सकता है. पूरे जिगर की कोशिकाओं को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया यांत्रिक विधियों, जाली 2 के माध्यम से जिगर मजबूर एक क्हान प्रकार के बरतन 3 में ग्लास मोतियों के साथ एक जिगर का टुकड़ा मिलाते हुए, इन वर्षों में आदि ढीला pestles 4,5 के साथ कांच homogenizers का उपयोग शामिल है, यांत्रिक विधियों से बाहर गिर गया है कारण कोशिका झिल्ली को नुकसान और पृथक hepatocytes 6,7 के समारोह के नुकसान के लिए एहसान. नतीजतन, एक enzymatic विधि का उपयोग वर्तमान में hepatocytes के अलगाव के लिए मुख्य विधि है.
बेरी और मित्र 8 चूहों में पोर्टल शिरा के माध्यम से जिगर के माध्यम से collagenase और hyaluronidase perfused जब एक enzymatic विधि का उपयोग hepatocytes के अलगाव काफी सुधार किया गया था. यह छिड़काव की प्रक्रिया के लिए अग्रणी, एंजाइमों कोशिकाओं के बहुमत के साथ निकट संपर्क में आने की अनुमति देने के लिए वाहिका संरचना का उपयोग कियाhepatocytes 8 की उपज में 6 गुना वृद्धि हुई है. इसके अलावा, इस पद्धति लगभग पृथक vesicles में जालिका का कोई परिवर्तन नहीं है और कोई mitochondrial क्षति 8 के साथ, उनकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा है कि कोशिकाओं झुकेंगे.
इस विधि जिगर सेल अलगाव के लिए एक दो कदम छिड़काव प्रक्रिया का बीड़ा उठाया है, जो Seglen 1, द्वारा संशोधित किया गया था. इस प्रक्रिया में, चूहा जिगर सीए 2 + 1 युक्त collagenase बफर के साथ छिड़काव के बाद सीए 2 + मुक्त बफर के साथ perfused है. दूसरे चरण में सीए 2 + के अलावा इष्टतम collagenase गतिविधि 1,9 के लिए आवश्यक है, जबकि पहले चरण में सीए 2 + को हटाने, desmosomes को बाधित करने में मदद करता है.
ऊपर वर्णित प्रकाशित काम चूहों में प्रदर्शन किया गया है कि यह देखते हुए, इस लेख गुंजन से उच्च व्यवहार्यता साथ hepatocytes के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक संशोधित प्रक्रिया का प्रदर्शन करना हैएक यकृत. मानव hepatocytes के उपयोग शोधों के लिए और पशु मॉडल का उपयोग कर प्रयोगों मान्य के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है. इस अध्ययन में इस्तेमाल मानव जिगर के टुकड़े मानव ऊतकों और सेल रिसर्च फाउंडेशन, एक राज्य नियंत्रित गैर लाभ नींव 10 के माध्यम से शासन के लिए सहमति से हासिल किया गया. एक रोगविज्ञानी निदान के लिए आवश्यक था क्या हटाया के बाद, जिगर के टुकड़े शेष ऊतक से एकत्र किए गए थे. पैथोलॉजिस्ट ने बंद sectioned ऊतक आकृति विज्ञान जिगर लकीर के बाद लकीर हाशिए से प्राप्त स्वस्थ ऊतकों था.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल उच्च व्यवहार्यता और पवित्रता के साथ मानव hepatocytes के अलगाव में यह परिणाम है. इन परिणामों को प्राप्त करने के लिए, यह जिगर का एक उपयुक्त टुकड़े के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है. जिगर का टुकड़?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के अनुसंधान के लिए मानव ऊतकों उपलब्ध बनाता है जो मानव ऊतकों और सेल रिसर्च फाउंडेशन, द्वारा संभव बनाया गया था. और Hepacult GmbH इस काम के लिए वित्तीय सहायता संघीय शिक्षा मंत्रालय और रिसर्च (: वर्चुअल लिवर नेटवर्क, अनुदान संख्या 0315759 अनुदान नाम) से प्राप्त किया गया था. हमारे धन्यवाद भी जिगर छिड़काव और hepatocyte अलगाव से बाहर ले जाने के लिए जिगर के नमूने और सेल अलगाव कोर सुविधा से तकनीकी सहायकों की वसूली के लिए Grosshadern अस्पताल ऊतक बैंक से तकनीकी सहायकों के पास जाओ. विशेष रूप से, हम वीडियो में इस प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए Natalja Löwen धन्यवाद देना चाहूंगा. अंत में, हम वीडियो के योजनाबद्ध सिंहावलोकन में चित्रा 1 के लिए चित्र और आंकड़े बनाने के लिए Natalja Löwen और Edeltraud Hanesch धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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