二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離
Summary
ヒト肝細胞の単離のための修飾された二工程コラゲナーゼ灌流手順が記載されている。この方法はまた、他の哺乳動物の肝臓にも適用することができる。単離された肝細胞は、それらのような肝臓の再生、薬物動態および毒物学などの分野での科学的研究に適したモデル作り、高い収率および生存度で提供されています。
Abstract
肝臓、例外的な再生能力を有する器官は、解毒、代謝及び恒常性などの機能の広い範囲を実行する。このように、肝細胞は、研究課題の多種多様のための重要なモデルである。特に、ヒト肝細胞の使用は、薬物動態、毒性、肝再生および翻訳研究の分野で特に重要である。したがって、この方法は、Seglen 1によって記載されるように肝細胞を単離するために2段階コラゲナーゼ灌流手順の修正版を提示する。
以前に、肝細胞は、機械的な方法によって単離されている。しかし、酵素法は、肝細胞が分離した後にその構造的完全性と機能を保持するように優れていることが示されている。ここで紹介するこの方法は、77±10％の生存と肝細胞の大規模な収率でヒトの肝臓片と結果に対するラットの肝臓のために以前に設計された方法を適応させる。メインこの手順の違いは、血管のカニューレ挿入するプロセスである。また、ここで説明する方法はまた、匹敵する肝臓または血管サイズを有する他の種由来の肝臓に適用することができる。
Introduction
肝細胞懸濁液を機械的または酵素的方法によって肝臓から調製することができる。全体の肝細胞を調製するために使用される機械的な方法は、チーズクロス2を介して肝臓を強制カーンシェーカー3におけるガラスビーズの肝臓片を振盪、長年にわたりなど緩い乳棒4,5有するガラスホモジナイザーを用いて、機械的な方法は、外に落ちて含むにより、細胞膜の損傷と単離肝細胞6,7の機能喪失に有利に働く。したがって、酵素的方法の使用は、現在、肝細胞の単離のための主要な方法である。
ベリーと友達8は 、ラットにおける門脈経由で肝臓をコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼを灌流したとき、酵素法を用いて肝細胞の単離は大きく改善されました。この灌流過程を導く、酵素は細胞の大部分に密着できるようにするために血管系を利用した肝細胞8の収量の6倍の増加。さらに、この方法は、事実上孤立小胞への小胞体の変換なしなしミトコンドリア損傷8で、その構造的完全性を保持された細胞が得られた。
この方法は、肝細胞の単離のために二段階灌流手順を開拓Seglen 1によって改変した。この手順では、ラットの肝臓のCa 2 +を含有する1コラゲナーゼ緩衝液で灌流、続いてのCa 2 +を含まない緩衝液で灌流される。第二工程におけるCa 2 +の添加は、最適なコラゲナーゼ活性1,9に必要とされている間第一工程におけるCa 2 +の除去は、デスモソームを破壊するのに役立つ。
上記の発表された研究は、ラットで行われたことを考えると、この記事では、ハムから高い生存して肝細胞の単離に使用することができます変更された手順を実証することを目的と肝臓。ヒト肝細胞の使用は、トランスレーショナル研究のための動物モデルを用いた実験を検証するための重要なままです。本研究で用いたヒト肝臓片を、ヒト組織および細胞研究基金、国営の非営利財団10を通じてガバナンスの同意を得て取得した。病理学者は、診断のために必要であったものを除去した後、肝臓片を残りの組織から採取した。病理学者によって区画さ組織は、形態学的に肝切除後の切除縁から得た健康な組織だった。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、高い生存率および純度のヒト肝細胞を単離することになる。これらの結果を達成するためには、肝臓の適切な個数で開始することが重要である。肝臓の一部は、1切断面を除くすべての表面上でそのままグリソン鞘を持つ必要があります。別の重要な要因は、異なるバッチの消化後11肝細胞の生存率の著しい違いをもたらすことができるように、使用されるコラゲ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、研究のためのヒト組織を利用できるようになり、ヒト組織および細胞研究財団、によって可能になりました。そしてHepacult社、この仕事のための財政支援は、連邦教育研究省（：バーチャル肝ネットワーク、助成金番号0315759助成名）から受信されました。私たちのおかげで、また肝灌流および肝細胞の分離を実施するための肝臓サンプルおよび細胞単離基盤施設からの技術的なアシスタントの収集のためGrosshadern病院組織バンクからの技術的なアシスタントにアクセスしてください。特に、我々はビデオでこの手順を実証するためのNataljaレーヴェンに感謝したいと思います。最後に、我々は、ビデオの概略の図1のためのイラストや図形を作成するためのNataljaレーヴェンとEdeltraud Haneschに感謝したいと思います。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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