Isolering av humane hepatocytter av en to-trinns Collage Perfusjons Prosedyre
Summary
En modifisert to-trinns kollagenase perfusjon fremgangsmåte for isolering av humane hepatocytter, er beskrevet. Denne metoden kan også brukes til andre pattedyr lever. De isolerte hepatocytter er tilgjengelig i høy yield og levedyktighet, noe som gjør dem en passende modell for vitenskapelig forskning på områder som for eksempel leveren regenerasjon, farmakokinetikk og toksikologi.
Abstract
Leveren, et organ med en eksepsjonell regenerering kapasitet, utfører en rekke funksjoner, slik som avgiftning, metabolisme og homeostase. Som sådan, hepatocytter er en viktig modell for et stort utvalg av forskningsspørsmål. Spesielt er bruken av humane hepatocytter spesielt viktig innen farmakokinetikk, toksikologi, lever regenerering og translasjonsforsking. Således presenterer denne metoden en modifisert versjon av en to-trinns kollagenase perfusjon fremgangsmåte for å isolere hepatocytter som beskrevet av Seglen 1..
Tidligere har hepatocytter blitt isolert ved hjelp av mekaniske metoder. Imidlertid har enzymatiske fremgangsmåter vist seg å være overlegen i hepatocytter beholde sin strukturelle integritet og funksjon etter isolering. Denne metoden er presentert her tilpasser den fremgangsmåten som tidligere utformet for rottelever til humane leverstykker og resulterer i et stort utbytte av hepatocytter med en levedyktighet på 77 ± 10%. HovedForskjellen i denne fremgangsmåten er prosessen cannulization av blodkar. Videre kan fremgangsmåten som beskrives her også brukes på lever fra andre arter med sammenlign lever eller blod fartøystørrelser.
Introduction
En levercellesuspensjonen kan bli fremstilt fra leveren av mekaniske eller enzymatiske fremgangsmåter. Mekaniske metoder som brukes til å forberede hele leverceller inkluderer tvinger leveren gjennom cheesecloth 2, risting en lever stykke med glassperler i en Kahn shaker 3, ved hjelp av glass homogenizers med løse pestles 4,5 osv. Gjennom årene har mekaniske metoder falt ut av fordel på grunn av den skade på cellemembraner, og tap av funksjon av de isolerte hepatocytter 6,7. Følgelig er bruken av en enzymatisk metode i dag den viktigste metoden for isolering av hepatocytter.
Isolering av hepatocytter ved hjelp av en enzymatisk metode økte betraktelig da Berry og Venn 8 perfundert collagenase og Hyaluronidase gjennom leveren via portvenen hos rotter. Denne perfusjon prosess utnyttes i vaskulaturen til å tillate de enzymer for å komme i nær kontakt med de fleste av cellene, noe som fører tilen 6-dobling i yield på hepatocytter åtte. Videre, denne metoden ga celler som beholdt sin strukturelle integritet, med nesten ingen transformasjon av endoplasmatiske retikulum i isolerte vesikler og ingen mitokondriell skade åtte.
Denne metoden ble endret av Seglen en, som pioner en to-trinns perfusjon prosedyre for levercelleisolasjon. I denne prosedyren, er rottelever perfundert med en Ca2 +-fri buffer etterfulgt av perfusjon med en collagenase-buffer inneholdende Ca 2 + 1. Fjerningen av Ca 2 + i det første trinn bidrar til å forstyrre desmosomes, mens tilsetningen av Ca 2 + i det andre trinnet er nødvendig for optimal kollagenaseaktivitet 1,9.
Gitt at det publiserte arbeid som er beskrevet ovenfor er blitt utført på rotter, har som mål denne artikkelen for å demonstrere en modifisert prosedyre som kan anvendes for isolering av hepatocytter med høy levedyktighet fra humen lever. Bruken av humane hepatocytter fortsatt viktig for translasjons forskning og for validering av forsøk under anvendelse av dyremodeller. De humane lever brikker som brukes i denne studien ble kjøpt med samtykke for styring gjennom menneskelig vev og Cell Research Foundation, en statskontrollerte non-profit stiftelse 10. Etter en patolog fjernet det som var nødvendig for å stille diagnosen, ble lever stykker samlet inn fra de gjenværende vev. Vevet delt av ved patologen var morfologisk friskt vev hentet fra reseksjonsrender etter leverreseksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen resulterer i isoleringen av humane hepatocytter med høy levedyktighet og renhet. For å oppnå disse resultater, er det viktig å starte med et passende stykke av leveren. Den del av leveren bør ha intakt Glisson sin kapsel på alle overflater bortsett fra en snittflaten. En annen viktig faktor er bestemt batch av collagenase brukes, som ulike grupper kan føre til store forskjeller i viabilities av hepatocytter etter fordøyelsen 11. Derfor bør ulike grupper av kollagenase testes og batc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble gjort mulig av menneskelig vev og Cell Research Foundation, som gjør menneskelig vev tilgjengelig for forskning. Økonomisk støtte til dette arbeidet ble mottatt fra den føderale departementet for utdanning og forskning (stipend navn: Virtual Liver Network, stipend Nummer: 0315759) og Hepacult GmbH. Vår takk går også til de tekniske assistenter fra Grosshadern Hospital Tissue bank for innsamling av leverprøver og de tekniske assistenter fra Cell Isolation Kjerne Facility for gjennomføring av leverperfusjon og hepatocytter isolasjon. Spesielt ønsker vi å takke Natalja Löwen for å demonstrere denne prosedyren i videoen. Til slutt vil vi gjerne takke Natalja Löwen og Edeltraud Hanesch for å lage illustrasjonene til figur 1 og tallene i skjematisk oversikt over videoen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology–head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
