El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos
Summary
Se describe un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas modificado para el aislamiento de hepatocitos humanos. Este método también se puede aplicar a otros hígados de mamíferos. Los hepatocitos aislados están disponibles con un alto rendimiento y la viabilidad, por lo que un modelo adecuado para la investigación científica en áreas como la regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.
Abstract
El hígado, un órgano con una capacidad de regeneración excepcional, lleva a cabo una amplia gama de funciones, tales como la desintoxicación, el metabolismo y la homeostasis. Como tal, los hepatocitos son un modelo importante para una gran variedad de preguntas de investigación. En particular, el uso de hepatocitos humanos es especialmente importante en los campos de la farmacocinética, la toxicología, la regeneración del hígado y la investigación de translación. Por lo tanto, este método presenta una versión modificada de un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas para aislar los hepatocitos como se ha descrito por Seglen 1.
Anteriormente, los hepatocitos han sido aislados por métodos mecánicos. Sin embargo, los métodos enzimáticos han demostrado ser superior como hepatocitos conservan su integridad y función estructural después del aislamiento. Este método que aquí se presenta se adapta el método previamente diseñado para hígados de rata a pedazos de hígado humano y los resultados en un gran rendimiento de hepatocitos con una viabilidad de 77 ± 10%. La principaldiferencia en este procedimiento es el proceso de cannulization de los vasos sanguíneos. Además, el método descrito aquí también se puede aplicar a los hígados de otras especies con tamaños de hígado o de los vasos sanguíneos comparables.
Introduction
Una suspensión de células de hígado puede prepararse a partir del hígado por métodos mecánicos o enzimáticos. Los métodos mecánicos utilizados para preparar las células del hígado enteros incluyen obligar al hígado a través de una gasa 2, agitando un trozo de hígado con perlas de vidrio en un agitador de Kahn 3, utilizando homogeneizadores de vidrio con morteros sueltas 4,5 etc Con los años, los métodos mecánicos han caído en favor debido a los daños a las membranas celulares y la pérdida de función de los hepatocitos aislados 6,7. En consecuencia, el uso de un método enzimático es actualmente el principal método para el aislamiento de hepatocitos.
Aislamiento de hepatocitos utilizando un método enzimático mejoró notablemente cuando Berry y Friend 8 perfundidos colagenasa y hialuronidasa a través del hígado a través de la vena porta en ratas. Este proceso utiliza la perfusión de la vasculatura para permitir que las enzimas entran en estrecho contacto con la mayoría de las células, conduciendo aun aumento de 6 veces en el rendimiento de hepatocitos 8. Además, este método produjo células que conservan su integridad estructural, prácticamente sin transformación del retículo endoplásmico en vesículas aisladas y ningún daño mitocondrial 8.
Este método se modificó por Seglen 1, que fue pionero en un procedimiento de perfusión en dos etapas para el aislamiento de células del hígado. En este procedimiento, el hígado de la rata se perfunde con un tampón de Ca2 + libre seguido de la perfusión con un tampón de colagenasa que contiene Ca 2 + 1. La eliminación de Ca 2 + en la primera etapa ayuda a romper los desmosomas, mientras que se requiere la adición de Ca 2 + en el segundo paso para la actividad de la colagenasa óptimo 1,9.
Dado que el trabajo publicado descrito anteriormente se ha realizado en ratas, este artículo tiene como objetivo demostrar un procedimiento modificado que se puede utilizar para el aislamiento de hepatocitos con alta viabilidad de zumbidoun hígados. El uso de hepatocitos humanos sigue siendo importante para la investigación traslacional y para la validación de los experimentos con modelos animales. Los pedazos de hígado humano utilizados en este estudio fueron obtenidas con el consentimiento de la gobernanza a través de la Fundación Tejido Humano y la investigación con células, una fundación sin fines de lucro controladas por el Estado 10. Después de un patólogo elimina lo que se requiere para el diagnóstico, pedazos de hígado se recogieron a partir del tejido restante. El tejido seccionado por el patólogo era morfológicamente tejido sano obtenido a partir de los márgenes de resección después de la resección hepática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo da como resultado el aislamiento de hepatocitos humanos con una alta viabilidad y pureza. Con el fin de alcanzar estos resultados, es importante comenzar con una pieza adecuada de hígado. El trozo de hígado debe tener la cápsula de Glisson intacta en todas las superficies excepto por 1 superficie de corte. Otro factor importante es el lote particular de colagenasa utilizado, como diferentes lotes pueden dar lugar a marcadas diferencias en viabilidades de los hepatocitos después de la digestión 1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido posible gracias a la Fundación de tejidos y células humanas de Investigación, lo que hace que los tejidos humanos disponibles para la investigación. Se recibió apoyo financiero para este trabajo por parte del Ministerio Federal de Educación e Investigación (nombre subvención: Virtual Network hígado, el número de concesión: 0.315.759) y Hepacult GmbH. También damos las gracias a los asistentes técnicos del Banco de tejidos Großhadern hospital para la recogida de las muestras de hígado y los asistentes técnicos del Fondo para el Core aislamiento de células para llevar a cabo la perfusión del hígado y el aislamiento de hepatocitos. En particular, nos gustaría dar las gracias a Natalja Löwen para demostrar este procedimiento en el video. Por último, nos gustaría dar las gracias a Natalja Löwen y Edeltraud Hanesch para la creación de las ilustraciones de la figura 1 y las figuras en el resumen esquemático del video.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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