İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur.
Karaciğer, istisnai bir rejenerasyon kapasitesine sahip bir organ, örneğin detoks, metabolizma ve homeostasis gibi işlevleri geniş bir yelpazede, yürütmektedir. Gibi, hepatositler araştırma soruları büyük bir çeşitlilik için önemli bir model vardır. Özellikle, insan hepatosit kullanımı farmakokinetik, toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve translasyonel araştırma alanlarında özellikle önemlidir. Bu yüzden, bu yöntem, Seglen 1 tarafından tarif edildiği gibi hepatositleri izole etmek için iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedürünün modifiye edilmiş bir versiyonunu göstermektedir.
Daha önce, hepatositler, mekanik yöntemlerle izole edilmiştir. Bununla birlikte, enzimatik yöntemler hepatosit izolasyonundan sonra, yapısal bütünlüğü ve işlevi muhafaza üstün olduğu gösterilmiştir. Burada yer Bu yöntem, 77 ±% 10 arasında bir canlılığı ile hepatosit büyük bir verimle insan karaciğer parçaları ve sonuçlar sıçan karaciğer için daha önce tasarlanmış yöntemini uyarlar. AnaBu prosedürde fark kan damarlarının kanülasyon işlemidir. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, ayrıca, karaciğer karşılaştırılabilir veya kan damarı boyutları ile diğer türlerden elde edilen karaciğer uygulanabilir.
Bir karaciğer hücre süspansiyonu, mekanik ya da enzimatik yöntemlerle karaciğer hazırlanabilir. Bütün karaciğer hücreleri hazırlamak için kullanılan mekanik yöntemler, tülbentten 2 vasıtasıyla karaciğeri zorlayan bir Kahn çalkalayıcı 3 cam boncuklar ile bir karaciğer parçası sallayarak, yılda vb gevşek havan elleri 4,5 ile cam homohenizatörlerin kullanarak dahil, mekanik yöntemler dışına düşmüş nedeniyle hücre zarlarına hasar ve izole edilmiş hepatositlerin 6,7 fonksiyon kaybına lehine. Sonuç olarak, bir enzimatik yöntem şu anda kullanımı hepatositlerin izolasyonu için ana yöntem.
Berry ve Friend 8 sıçanlarda portal ven aracılığıyla karaciğerden kolajenaz ve hiyalüronidaz perfüze zaman, bir enzimatik yöntem ile hepatositlerin izolasyonu büyük ölçüde geliştirilmiştir. Bu perfüzyon işlemi yol açan, enzimler, hücrelerin çoğunluğu ile yakın temas için izin vermek üzere damarsal kullanılanhepatositlerin 8 veriminde 6-katlık bir artış. Bundan başka, bu yöntem, hemen hemen izole vezikülleri içine endoplazmik retikulum hiçbir dönüşüm ve hiçbir zarar mitokondriyal 8, yapısal bütünlüğünü muhafaza hücreleri elde edildi.
Bu yöntem, karaciğer hücre izolasyonu için iki aşamalı bir prosedür perfüzyon öncülük Seglen 1, modifiye edilmiştir. Bu prosedürde, sıçan karaciğer Ca 2 + 1 ihtiva eden bir kolajenaz perfüzyon tampon maddesi ile, ardından bir Ca2 + serbest tamponu ile perfüze edilmiştir. Ikinci aşamada Ca 2 + eklenmesinin uygun kolajenaz aktivitesi 1.9 için gerekli iken, birinci aşamada Ca 2 + kaldırılması, dezmozomlar bozmak için yardımcı olur.
Yukarıda tarif edilen yayınlanmış çalışma sıçanlarda gerçekleştirildi olduğu göz önüne alındığında, bu makalede yüksek uğultu canlılığı ile hepatositlerin izolasyonu için kullanılabilecek modifiye edilmiş bir prosedürü ortaya koymayı amaçlamaktadırBir ciğeri. İnsan hepatositlerinin kullanılması translasyonel araştırma için ve hayvan modelleri kullanılarak deneyler doğrulamak için önemli olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada kullanılan insan karaciğer parçaları İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı, bir devlet kontrolündeki kâr amacı gütmeyen vakfın 10 ile yönetişim için rıza ile elde edildi. Bir patolog tanı için gerekli ne uzaklaştırıldıktan sonra, karaciğer parçaları ve geri kalan dokulardan toplanmıştır. Patolog tarafından kapalı kesitli doku morfolojik karaciğer rezeksiyonu sonrası rezeksiyon marjları elde edilen sağlıklı doku oldu.
Bu protokol, yüksek sağlamlık ve saflıkta insan hepatositlerinin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu sonuçları elde etmek için, bu karaciğer uygun bir parça ile başlamak önemlidir. Karaciğer parçası 1 kesme yüzeyi hariç tüm yüzeylerde bozulmadan Glisson kapsülü olmalıdır. Bir diğer önemli faktör farklı partisi sindirim 11 sonra hepatositlerin canlılığında belirgin farklılıklara neden olabilir olarak, kullanılan kolajenazın belirli bir küme olduğu. Bu nedenle, kolajenaz, farklı…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma araştırma için insan dokuları kullanılabilir hale İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı tarafından mümkün olmuştur. Ve Hepacult GmbH bu iş için finansal destek Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (: Sanal Karaciğer Ağ, hibe sayısı 0.315.759 hibe adı) alındı. Bizim sayesinde de karaciğer perfüzyon ve hepatosit izolasyonu yapılması için karaciğer örnekleri ve Hücre İzolasyon Çekirdek Tesisinden teknik asistanların koleksiyonu için Grosshadern Hastanesi Doku bankası teknik asistanlar gidin. Özellikle, biz video Bu prosedürü göstermek için Natalja Löwen teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, videonun şematik genel Şekil 1 için illüstrasyonlar ve şekiller oluşturma için Natalja Löwen ve Edeltraud Hanesch teşekkür etmek istiyorum.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
Scalpel | Feather | 320010 | |
Forceps | Omnilab | 5171014 | |
Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
Surgical hood | Barrier | 42072 | |
Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
Hepes | Roth | 9105.3 | |
Potassium chloride | Serva | 26868 | |
Albumin | Biomol | 01400-2 | |
Glucose | Serva | 22700 | |
Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
Cold storage solution | Hepacult GmbH |