Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule
Summary
In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.
Abstract
Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All'attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l'alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l'analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l'analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.
Introduction
Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all'interno di una vasta popolazione di cellule 1-3, in particolare segnalazione elabora 4 o la quantità di biomolecole come proteine intracellulari 5,6, metaboliti e cofattori 7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l'adattamento delle cellule e l'evoluzione 9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro 10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi studi rivelano le diverse risposte delle cellule dopo trattamento con sostanze chimiche bioattive.
Negli ultimi anni, molte piattaforme analitiche sono state sviluppate che facilitano l'analisi di cellule viventi singole o la composizione chimica del contenuto cellulare. Mentre fluorescente delle cellule attivate (FACS) è l'oro stAndard per analisi molto alto-capacità di singole cellule viventi, il metodo non può essere impiegato per la quantificazione di composti intracellulari o secrete. L'emergere di piattaforme microfluidica ha promesso nuove strategie analitiche per il posizionamento, il trattamento e l'osservazione delle singole cellule. Una pietra miliare nella microfluidica è stato raggiunto con l'integrazione di PDMS valvole flessibili realizzate da Quake e collaboratori 14,15. Queste valvole sono utili poiché possono isolare regioni sul chip, ad esempio separare due culture 16. Inoltre, sono particolarmente applicabile per l'analisi di singole cellule e quindi contribuire a ridurre i problemi di diluizione degli analiti. La potenza di questo approccio per l'analisi singola cellula è stato recentemente dimostrato da Hansen e colleghi, che hanno analizzato l'espressione genica da centinaia di singole cellule in parallelo 17.
Quando il targeting proteine e metaboliti, l'analisi è molto difficile a causa della mancanza di un adeguatometodi mplification, il gran numero di diversi composti presenti, e le loro variazioni di natura chimica. Inoltre, la maggior parte delle biomolecole intracellulari dovrebbero essere presenti in basso numero di copie nell'ordine di qualche decina di migliaia 18, da cui il metodo analitico utilizzato deve avere una elevata sensibilità. Saggi più potenti come immunosaggi e immunoenzimatici (ELISA) sono difficili da integrare in dispositivi microfluidici quanto richiedono vari lavaggi e le fasi di incubazione e immobilizzazione superficie.
A causa di questi problemi, non è sorprendente che solo alcuni esempi sono stati riportati in cui le proteine o metaboliti sono stati quantificati a livello di singola cellula. Per esempio, studi sulla secrezione di composti fluorescenti sono stati segnalati 19,20. Recentemente, l'implementazione con ELISA è stata presentata per l'analisi di secrete (non fluorescente) proteine da una coltura cellulare (cellule THP-1) 21 e singolo (immune) cellule 10. Targeting proteine intracellulari, Shi et al. Sviluppato un dispositivo microfluidico che ha facilitato l'identificazione di proteine intracellulari per l'analisi delle vie di segnalazione nelle cellule tumorali mediante un immunodosaggio 11. Tuttavia, solo quantità relative di proteine sono stati determinati e nessuna amplificazione enzimatica è stato utilizzato per aumentare il segnale per le proteine a bassa abbondanza.
Recentemente, siamo stati in grado di combinare una cella singola cattura Microdevice con saggi di fluorescenza 8 e immunoassays 22 (Figura 1). Le cellule sono passivamente intrappolati in strutture ostacolo microsized, che permettono di alimentazione e (rapido) scambio di medie e di altri agenti chimici senza alcun movimento delle cellule. Una valvola ad anello attorno a ciascuna trappola consente l'isolamento della cella in un volume molto piccolo ("microcamera"). Questa valvola viene attivata subito dopo aver introdotto una cella-lisi (hypoosmolar) tampone, eglince prevenire molecole intracellulari o molecole secrete a diffondere via. Ancora più importante, a causa delle ridotte dimensioni del volume (625 pl) è evitata grande diluizione delle molecole. Inoltre, poiché lisi e analisi vengono eseguite nella stessa posizione nel chip, non vi è alcuna perdita di analiti dovuti al trasporto. La progettazione di chip qui descritto comprende 8 righe alterne di 7 o 8 microchambers, per un totale di 60 microchambers. Le camere sono azionati in file, in modo che la contaminazione incrociata lungo una linea è preclusa.
La piattaforma può essere utilizzata in combinazione con saggi di fluorescenza e test immunologici (Figura 1D). Per questi ultimi, abbiamo stabilito protocolli per l'immobilizzazione degli anticorpi, che sono compatibili con la produzione di chip e processo di assemblaggio. Quindi la piattaforma apre la strada a test sensibile, affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l'analisi di ienzimi ntracellular e secrete (quantificazione relativa da saggi enzimatici), cofattori intracellulari, proteine e piccole molecole (quantificazione assoluta mediante saggi endpoint o ELISA). Nel seguito si descrive il processo di fabbricazione di chip mediante multistrato litografia morbida e protocolli per patterning degli anticorpi tramite stampa microcontact e chimica di superficie. Inoltre, alcuni esempi di utilizzo del chip e le operazioni sono dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l'analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi cit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Tom Robinson per la lettura delle bozze del manoscritto, C. Bärtschi e H. Benz per la realizzazione del sistema di controllo della pressione custom-built. Vorremmo inoltre ringraziare l'uso della funzione stanza pulita prima e la microscopia ottica Center (LMC), sia presso l'ETH di Zurigo. Il lavoro è stato finanziato dalla Merck Serono e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del 7 ° Programma Quadro (ERC Starting Grant, progetto n. 203.428, nμLIPIDs).
Materials
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
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