Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

Résumé

Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.

Résumé

Le système nerveux est souvent décrite comme une composante câblé du corps, même si elle est un système d'organe considérablement fluide qui réagit à des stimuli externes, d'une manière stéréotypée cohérente, tout en conservant une incroyable souplesse et la plasticité. Contrairement au système nerveux central (SNC), du système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes, mais nous avons à peine commencé à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. En utilisant le poisson zèbre comme un système modèle, nous avons l'occasion sans précédent d'études régénératrices conjoints avec l'imagerie in vivo et les manipulations génétiques. Les nerfs périphériques sont constitués d'axones entourés par des couches de cellules gliales et du tissu conjonctif. Les axones sont ensheathed par myélinisants ou non-myélinisation des cellules de Schwann, qui sont à leur tour enveloppé dans un fascicule d'une gaine cellulaire appelée la perineurium. Suite à une blessure, les nerfs périphériques adultes ont la capacité remarquable à remove endommagé débris axonale et les objectifs re-innervent. Afin d'étudier le rôle des cellules gliales tout périphérique dans PNS régénération, nous décrivons ici un essai de dissection transversale de l'axone qui utilise un laser à colorant pompé l'azote disponible dans le commerce à axotomize nerfs moteurs chez le poisson zèbre transgénique en direct. Nous décrivons plus loin les méthodes de coupler ces expériences à l'imagerie time-lapse de nerfs blessés et de contrôle. Ce paradigme expérimental peut être utilisé non seulement pour évaluer le rôle que jouent les cellules gliales dans la régénération des nerfs, mais peut aussi être la plate-forme pour élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la réparation du système nerveux.

Introduction

Le poisson zèbre ont été largement utilisées pour étudier le développement du système nerveux en raison de leur transparence optique et la facilité de la transgénèse, qui, lorsqu'il est couplé, pour permettre l'imagerie spectaculaire des comportements cellulaires dynamiques dans un embryon vivant. En outre, parce que le poisson-zèbre et les mammifères partagent presque tous les gènes nécessaires à la formation du système nerveux, l'information cellulaire et moléculaire collectées dans cet organisme modèle est directement rattachables à d'autres espèces de vertébrés. Même si incroyablement puissant pour les études du développement neural, le poisson zè....

Protocole

1. Préparation et montage des embryons de poisson zèbre pour l'ablation et l'imagerie en direct

1. Préparer un stock de 0,8% agarose bas point de fusion dans l'eau oeuf. Aliquote en 13X tubes de culture jetables de 100 mm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
2. Poisson zèbre adulte Cross contenant des transgènes intégrés de façon stable à étiqueter fluorescence neurones moteurs et types de cellules gliales d'intérêt. Recueillir embryons de poisson zèbre en eau d'œuf et placer dans un incubateur 28,5 ° C pour la bonne mise en scène plus tard ^3.
3. A environ 24 fécondation post h (HPF), éliminer l'....

Résultats

L'essai décrit ici peut être utilisé pour évaluer la réponse des cellules gliales et les autres populations de cellules nerveuses associées à des lésions axonales in vivo. Film 1 montre un exemple d'une lésion du nerf créé en utilisant cette méthode et la réponse des cellules gliales voisines. Cette expérience a été réalisée dans Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) poisson zèbre, dans lequel les cellules gliales perineurial exprimer une membrane cible EGFP et neurones moteur.......

Discussion

Les étapes les plus critiques de ce modèle expérimental sont: 1) les larves correctement le montage de blessure et après l'imagerie in vivo et 2) l'étalonnage du laser et de sélectionner les paramètres d'alimentation correctes afin de créer une section du nerf propre qui entraîne des dommages extra-tissulaire minimale . Pour aider à assurer un axotomy succès pour l'imagerie in vivo et l'analyse ultérieure, monter larves multiple soit dans des plats à fond de verre individuels ou dan.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phenylthiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Agarose à faible point de fusion	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Boîtes de culture cellulaire, Fond en verre, Stérile, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Boîtes de Pétri à fond de verre monopuits 35 x 10 mm, 12 mm d’épaisseur	Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint Système laser avec tous les composants	Andor Technology - acheté par Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
Colorant Courmarin laser MicroPoint (435 nm)	Technologie Andor	MP-27-435-COLORANT