Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme
Summary
Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.
Abstract
Inanılmaz esneklik ve plastisite korurken, tutarlı, kalıplaşmış bir şekilde dış uyaranlara tepki oldukça akışkan organ olmasına rağmen sinir sistemi genellikle vücudun bir kablolu bileşeni olarak tanımlanmaktadır. Merkezi sinir sistemi farklı (MSS), periferik sinir sistemi (PNS) önemli tamir yeteneğine sahiptir, ama biz sadece bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamaya başladı. Bir model sistem olarak Zebra balığı kullanarak, in vivo görüntüleme ve genetik manipülasyon ile çift rejeneratif çalışmalara benzersiz bir fırsat var. Periferik sinir glia ve bağ doku tabakaları ile çevrili akson oluşmaktadır. Aksonlar perinöriyum adlı bir cep kılıf ile bir fasikül içine sarılmış da olan Schwann hücreleri, myelinating veya olmayan myelinating tarafından ensheathed edilir. Bir yaralanma sonrasında, yetişkin periferik sinir remo için muazzam bir kapasite varve aksonal enkaz ve yeniden innerve hedefleri zarar. PNS rejenerasyon tüm periferik glia rollerini araştırmak için, burada canlı transgenik zebrafish motor sinirleri axotomize ticari olarak satılan azot pompalı dye lazer kullanan bir akson transection tahlil açıklar. Biz daha fazla yaralı ve kontrol sinirlerin zaman atlamalı görüntüleme için bu deneyleri birkaç yöntemleri açıklar. Bu deneysel paradigma sadece glia sinir rejenerasyonu oyun değil, aynı zamanda sinir sistemi onarım yöneten moleküler mekanizmaların tanıtılması için bir platform olabilir rolünü değerlendirmek değil kullanılabilir.
Introduction
Zebra balığı nedeniyle optik şeffaflık sinir sisteminin geliştirilmesi çalışma ve transgenesis kolaylığı, hangi birleştiğinde, bir canlı embriyo dinamik hücre davranışları muhteşem görüntüleme sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebrabalıkları ve hemen hemen her memeli sinir sisteminin oluşumu, bu model organizma toplanan hücresel ve moleküler bilgileri için gerekli olan genleri paylaştığından Buna ek olarak, başka bir omurgalı türünün ile doğrudan ilişkilendirilebilir. Nöral gelişim çalışmaları için inanılmaz güçlü olsa da, Zebra balığı ve eşsiz özellikler de yaralanma sonrası sinir sistemi korumak ve yeniden mekanizmaları aydınlatmak için potansiyel var. Zebra balığı larvaları geç larva dönemlerinde onların translusensi korumak ve pigmentasyon etkili melanin üretimini veya pigment hücreleri eksikliği genetik mutantlar farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı ya ile bloke edilebilir. Bu nedenle, bu model organizma kullanarak yaralanma ve rejenerasyon çalışmayaşlı hayvanlarda iyon mevcuttur ve doğrudan sinir sistemini yeniden hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Bu yazıda, verimli ve tekrarlanabilir Zebra balığı larvalarının PNS içinde sinirler zarar nasıl açıklar. Bu yaralanma paradigma periferik glia ve bağışıklık hücrelerinin yanıtları yanı sıra rejenerasyon sırasında bu nüfus arasındaki etkileşimleri de dejenerasyon sadece eğitim için oldukça rahat, ancak.
PNS bir organizma çevre ile etkileşim ve hayatta kalmak için izin, merkezi sinir sistemi (MSS) ve cilt, organlar ve vücudun kas arasında bilgi aktarmak için gerekli olan motor ve duyu sinirleri karmaşık bir ağdır. Bu sinirler birlikte, Myelinating ve non-myelinating Schwann hücreleri ve perineurial Glia, yanı sıra bağ dokusu, aksonların örten ve sonuçta sinir olgun formu dahil olmak üzere çevresel glia. Bu sinirlerin yaralanması süreci k başlatırWallerian dejenerasyon 10 olarak nown. Aksonal parçalanma, bağışıklık işe alım, enkaz temizleme ve yenilenme Bu mekanizma çok kalıplaşmış ve genetik 1. düzenlenir. Memeli sistemlerde önceki çalışmalarda sinir dejenerasyonu ve rejenerasyon, 1, 2, 6, 8 sırasında Schwann hücrelerinin rolleri tanımlamışlardır. Sabit doku ya da hücre kültürü bu çalışmalarda, Schwann hücreleri sadece enkaz temizleme yardımcı olmak için yaralanma siteye makrofajlar işe değil, aynı zamanda miyelin fagositoz kendilerini destekli. Bu çalışmaların son derece bilgilendirici olmuştur, biz gerçek zamanlı olarak in vivo periferik akson hasarına görsel glial tepkiler daha önce hiç var ve başka çalışmalar bu olaylar sırasında çevre glia farklı sınıflar arasındaki ilişkiyi araştırdık.
Son zamanlarda, çeşitli laboratuarları biz burada açıklamak ne benzer Zebra balığı ve lazer aracılı akson hasarı kullanarak Wallerian dejenerasyon araştırdık <sup> 4, 5, 7, 9. Bu çalışmaların bazılarında, yüzeysel duyu sinir özel bir yerleşik, iki foton konfokal mikroskop 4, 5, 9 ile genç larvaları axotomized edildi. Başka bir çalışmada, hangi bizimkine çok benzer, ventral motor sinir içinde derin akson bir ticari lazer ablasyon sistemi 7 ile 5 günlük larvaları transeksiyon edildi. Bu deneysel set-up her ikisinde de, odak Wallerian dejenerasyon ve hem de akson ve bağışıklık hücreleri görüntülenmiştir vardı. Bu çalışmalar genişletmek için, daha olgun, miyelinli sinir ve tahlil dejenerasyon ve rejenerasyon sırasında tüm sinir ile ilişkili çevresel glia tepki ile eski larva motor aksonlar yaralanmasına açıklar.
Bunu yapmak için, biz de yaralı akson birlikte bu nüfus arasındaki etkileşimleri araştırmak üzere 6 motor sinirler ve 7 gün sonra döllenme (DPF) larva transect ve bireysel glial nüfus yanıtları görselleştirmek. Çift ve üçlü tra kullanarakbu Schwann hücrelerinin ve perineurial glia yanı sıra, aksonlar için bir gösterge de dahil olmak üzere çevresel etiket glia nsgenic hatları, böylece oluşan bir ticari olarak temin edilebilen lazer ablasyon sistemi kullanmak bir azot pompalanmış dönen bir disk konfokal sisteme bağlı boya lazeri (dalga boyu 435 nm) akson kesilerde oluşturmak için. Bu deneysel kurulum bize birbirine akson yaralanma ve ilişkileri özgü periferik motor akson yolları ve zaman atlamalı görüntü farklı glial nüfus yanıtları zarar, canlı, larva Zebra balığı görüntülemenizi sağlar. Bu protokol daha farklı bilimsel soruları için farklı transgenik çizgiler veya genetik mutantlar ile, farklı yaşlardaki Zebra balığı sinir yaralanmaları oluşturmak için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deneysel tasarım en kritik adımlar şunlardır: 1) in vivo görüntüleme ve 2 yaralanma ve sonraki için uygun montaj larva) temiz bir sinir kesisi oluşturmak için lazer kalibrasyon ve doğru güç ayarlarını seçerek bu minimal ekstra doku hasarı ile sonuçlanır . In vivo görüntüleme ve sonraki analiz için başarılı axotomy sağlamak için, tek tek cam alt yemekleri ya ya da bölücüler ile bir cam alt tabak birden fazla larva monte. Lazer kalibrasyon sonra, sinir …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar üstün teknik destek için değerli tartışmalar ve Nisabı Technologies, Inc için Kucenas Lab teşekkür etmek istiyorum. Çalışma Bilim ve Teknoloji Mükemmellik için UVa Fonu (FEST) (SK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O’Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O’Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
